Yangiliklar

Nature.com saytiga tashrif buyurganingiz uchun tashakkur.Siz foydalanayotgan brauzer versiyasi cheklangan CSS-ni qo'llab-quvvatlaydi.Eng yaxshi tajriba uchun yangilangan brauzerdan foydalanishni tavsiya qilamiz (yoki Internet Explorer-da Moslik rejimini o'chirib qo'ying).Shu bilan birga, doimiy qo'llab-quvvatlashni ta'minlash uchun biz saytni uslublarsiz va JavaScript-ni ishlatmasdan taqdim etamiz.
Saraton hujayralari hujayra stressini engish va rivojlanishda davom etish uchun turli mexanizmlarni ishlab chiqdi.Protein kinaz R (PKR) va uning oqsil faollashtiruvchisi (PACT) hujayra proliferatsiyasi va apoptozning inhibisyoniga olib keladigan turli xil stress signallarini kuzatuvchi dastlabki javob beruvchilardir.Biroq, saraton hujayralarida PACT-PKR yo'lining regulyatsiyasi asosan noma'lum bo'lib qolmoqda.Bu erda biz uzoq kodlashmagan RNK (lncRNA) aspartil tRNK sintetaza antisensi RNK 1 (DARS-AS1) PACT-PKR yo'lini inhibe qilishda bevosita ishtirok etishini va saraton hujayralarining ko'payishiga yordam berishini aniqladik.CRISPRi 971 saraton bilan bog'liq bo'lgan lncRNA ning keng ko'lamli funktsional skriningidan foydalanib, biz DARS-AS1 saraton hujayralari ko'payishining sezilarli darajada yaxshilanishi bilan bog'liqligini aniqladik.Shuning uchun DARS-AS1 nokauti hujayra proliferatsiyasini inhibe qiladi va in vitro turli xil saraton hujayralari liniyalarida saraton hujayralari apoptozini rag'batlantiradi va in vivo jonli ravishda o'simta o'sishini sezilarli darajada kamaytiradi.Mexanik ravishda DARS-AS1 to'g'ridan-to'g'ri PACT faollashtirish domeniga bog'lanadi va PACT-PKR o'zaro ta'sirini oldini oladi, shu bilan PKR faollashuvini, eIF2a fosforillanishini kamaytiradi va apoptotik hujayra o'limini inhibe qiladi.Klinik jihatdan DARS-AS1 ko'plab saratonlarda keng namoyon bo'ladi va bu lncRNKning haddan tashqari ko'payishi yomon prognozdan dalolat beradi.Ushbu tadqiqot DARS-AS1 lncRNA tomonidan PACT-PKR yo'lining saratonga xos tartibga solinishini tushuntiradi va saraton prognozi va davolash uchun yana bir maqsadni taqdim etadi.
Stressga moslashish qobiliyati saraton hujayralarining omon qolishi va ko'payishining muhim xususiyatidir.Saratonning tez ko'payishi va metabolik belgilari og'ir mikro muhitda cho'qqisiga chiqadi - ozuqa moddalarining etishmasligi, gipoksiya va past pH - bu hujayralar o'limi signalizatsiya yo'llarini qo'zg'atishi mumkin.P535, issiqlik zarbasi oqsillari 6, 7, KRAS8, 9 va HIF-110, 11, 12, 13 kabi stressga sezgir genlarning disregulyatsiyasi saraton kasalligida tez-tez kuzatiladi va shu bilan apoptozni bloklaydi va omon qolishga yordam beradi.
Protein kinaz R (PKR) muhim stress sensori va eukaryotik boshlash omili 2a (eIF2a) subunit kinazasi bo'lib, hujayra stressini hujayra o'limiga bog'laydigan translyatsion regulyatordir.PKR dastlab begona ikki zanjirli RNK (dsRNK) ni aniqlash orqali antiviral oqsil sifatida aniqlangan.Faollashgandan so'ng, PKR virusli va hujayrali oqsil sintezini inhibe qilish uchun eIF2a ni fosforlaydi14,15,16.PACT (PKR faollashtiruvchi oqsil) dsRNA17,18,19,20,21,22,23 yo'qligida birinchi PKR faollashtiruvchi oqsil sifatida aniqlangan.PKR bilan to'g'ridan-to'g'ri o'zaro ta'sir qilish orqali PACT turli xil stresslarni (zardobning ochligi, peroksid yoki arsenit bilan davolash) PKR va quyi oqim signalizatsiya yo'llariga o'tkazadi.EIF2a fosforillanishiga qo'shimcha ravishda, PACT vositachiligidagi PKR faollashuvi stress reaktsiyasi bilan bog'liq turli hodisalarni, shu jumladan PI3K/Akt24 yo'li orqali o'zgartirilgan redoks holatini, p5325,26 va NF-kB27,28 orqali DNKning shikastlanishini tekshirishni kuchaytiradi Transkripsiyani tartibga soladi, 29. Stressga javob berish, proliferatsiya, apoptoz va boshqa asosiy hujayra jarayonlaridagi muhim rolini hisobga olgan holda, PKR va PACT ko'plab kasalliklar, ayniqsa saraton uchun istiqbolli terapevtik maqsadlardir30,31,32,33.Biroq, bu pleiotropik funktsional va biologik ahamiyatga ega bo'lishiga qaramay, saraton hujayralarida PACT/PKR faolligini tartibga solish qiyinligicha qolmoqda.
lncRNA'lar 200 dan ortiq nukleotidlardan iborat bo'lgan protein kodlash potentsialiga ega bo'lmagan transkriptlardir.Eng ilg'or butun genom sekvensiyasi loyihalari minglab lncRNKlarni aniqlaganidan beri,35,36 ularning biologik funktsiyalarini tushuntirish uchun ko'p harakat qilindi.O'sib borayotgan tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, lncRNKlar ko'plab biologik jarayonlarda ishtirok etadi37, shu jumladan X-xromosoma inaktivatsiyasini tartibga solish38,39, imprinting40, transkripsiya41,42, translatsiya43 va hatto saraton o'sishi44,45,46,47.Ushbu tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, ko'plab lncRNAlar PACT/PKR yo'lida ishtirok etadi.Bunday tadqiqotlardan biri shuni ko'rsatdiki, lncRNA ASPACT PACT transkripsiyasini inhibe qilgan va PACT mRNKning yadroviy tutilishini oshirgan.Boshqa tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, lncRNA nc886 PKR bilan bog'lanadi va uning fosforlanishini inhibe qiladi49,50.Hozirgacha PACT vositachiligida PKR faollashuvini tartibga soluvchi lncRNA haqida xabar berilmagan.
Aspartil-tRNK sintetaza antisensi RNK 1 (DARS-AS1) onkogen lncRNA51,52,53,54 sifatida aniqlangan.MiP-194-5p53, miP-12952 va miP-532-3p51 ni tartibga solish orqali DARS-AS1 navbati bilan aniq hujayrali buyrak hujayrali karsinoma, qalqonsimon bez karsinomasi va kichik hujayrali o'pka karsinomasining o'sishiga yordam berishi ko'rsatilgan.Tong va uning hamkasblari, shuningdek, DARS-AS1 protein 39 (RBM39) RNKni bog'lovchi motivning barqarorligini saqlab, miyelom rivojlanishiga yordam berishini aniqladilar.Biroq, ushbu lncRNKning PACT-PKR faollashuvini tartibga solish va saraton hujayralarining stressga javob berishda ishtirok etishi haqida hech qanday tadqiqotlar o'tkazilmagan.
Bu erda biz CRISPRi tizimidan foydalangan holda keng miqyosli funktsiyani yo'qotish ekranini o'tkazdik va DARS-AS1 lncRNA bir necha turdagi saraton hujayralarining ko'payishiga yordam berishini aniqladik.Bundan tashqari, biz asosiy mexanizmni aniqladik: DARS-AS1 to'g'ridan-to'g'ri PACT bilan bog'lanadi, PACT va PKR bog'lanishini inhibe qiladi, eIF2a, pastki PKR substrati fosforlanishini oldini oladi va oxir-oqibat apoptotik hujayra o'limini inhibe qiladi.Xulosa qilib aytganda, bizning ishimiz DARS-AS1 lncRNAni PACT-PKR yo'lining regulyatori va saraton kasalligini davolash va prognoz qilish uchun potentsial maqsad sifatida ochib beradi.
Keng qamrovli genomik profiling tadqiqotlari saraton bilan bog'liq yuzlab lncRNAlarni aniqladi.Biroq, ularning vazifasi ko'p jihatdan noma'lumligicha qolmoqda56.Saraton rivojlanishida ishtirok etadigan istiqbolli lncRNA nomzodlarini aniqlash uchun biz CRISPRi tizimidan foydalangan holda SW620 kolorektal saraton hujayralari chizig'ida proliferatsiyani kamaytirish uchun funktsiyani yo'qotish ekranini o'tkazdik (1a-rasm).SW480 va SW620 yo'g'on ichak saratoni hujayralarining o'ziga xos xususiyati shundaki, ular bitta bemorda birlamchi va ikkilamchi o'smalardan olingan.Bu rivojlangan yo'g'on ichak saratoni rivojlanishidagi genetik o'zgarishlarni o'rganish uchun qimmatli taqqoslashni ta'minlaydi.Shuning uchun biz RNK ketma-ketligi yordamida kolorektal saraton hujayralarining (SW480 va SW620) transkriptomlarini tahlil qildik va nashr etilgan adabiyotlardan ba'zi potentsial funktsional lncRNAlarni to'pladik.Ushbu natijalarga asoslanib, biz salbiy nazorat qilish uchun 971 ta saraton bilan bog'liq lncRNA va 500 ta maqsadsiz sgRNA oligoslariga qaratilgan 7355 sgRNA oligosni o'z ichiga olgan birlashtirilgan sgRNA kutubxonasini ishlab chiqdik (Qo'shimcha ma'lumotlar 1).
CRISPRi tizimi yordamida skriningning sxematik tasviri.b skriningdan keyin sgRNKni boyitish.Gorizontal nuqtali chiziq log2 (katlama o'zgarishi) = ± 0,58 ni bildiradi.Vertikal nuqtali chiziq p qiymatini ko'rsatadi = 0,05.Qora nuqtalar maqsadli bo'lmagan sgRNKni ifodalaydi (NC sifatida belgilangan).Qizil nuqtalar DARS-AS1 ga qaratilgan sgRNKlardir.Moviy nuqtalar LINC00205 ga qaratilgan sgRNKlar bo'lib, ilgari tasvirlangan onkogen lncRNK.katlama o'zgarishi = (normallashtirilgan o'qish, 17-kun)/(normallashtirilgan o'qish, 0-kun).c DARS-AS1 sgRNK nokdatu hujayra o'sishini inhibe qildi.Xato chiziqlari uchta tajribaning ± standart og'ishini ifodalaydi.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 ikki dumli Talabaning t-testi.d o'smalarda DARS-AS1 ifodasi (TCGA ma'lumotlar to'plami).em BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP va COAD (TCGA ma'lumotlar to'plami) bo'lgan bemorlarning juftlashtirilgan normal va o'simta namunalarida DARS-AS1 ifodasi.p-qiymatlari juftlangan ikki dumli Student t-testi yordamida olingan.
Plazmidni qurish va lentivirusni qadoqlashdan so'ng, biz to'rtta mustaqil infektsiya tajribalarida yuqoridagi kutubxona bilan dCas9-SW620 yo'g'on ichak saratoni hujayra chizig'ini o'tkazdik.Ushbu infektsiyalar uchun infektsiyaning ko'pligi (MOI) 0,1-0,3 ni tashkil etdi, bu har bir hujayra faqat bitta sgRNK bilan transfektsiya qilinishi mumkinligini ko'rsatadi.18 kunlik in vitro madaniyatidan so'ng, maqsadli sgRNKlarning boyitish profili skriningdan so'ng kamaydi yoki ko'paydi, maqsadli bo'lmagan nazorat oligonükleotidlari soni esa skriningdan oldingi profilga nisbatan nisbatan o'zgarmadi, bu bizning maqsadimiz yuqori ekranga xos xususiyatga ega ekanligini ko'rsatadi. kutubxona.Guruch.1b va qo'shimcha jadval 1). Ilgari o'pka saratoni va jigar saratoni rivojlanishini rag'batlantirishi haqida xabar berilgan LINC00205 58,59,60 tekshirildi (log2 (katlama o'zgarishi) < -0,58, p qiymati <0,05), bu skrining ishonchliligini tasdiqlaydi (1b-rasm). Ilgari o'pka saratoni va jigar saratoni rivojlanishini rag'batlantirishi haqida xabar berilgan LINC00205 58,59,60 tekshirildi (log2 (katlama o'zgarishi) < -0,58, p qiymati <0,05), bu skrining ishonchliligini tasdiqlaydi (1b-rasm). LINC00205, o kotorom ranee soobshchalos, chto on sposobstvuet progressirovaniyu raka legkix va raka pecheni58, 59, 60, byl isklyuchen (log2 (kratnoe izmenie) <-0,58, snachenie p <0,05) 1b). O'pka saratoni va jigar saratoni rivojlanishini rag'batlantirish uchun ilgari xabar qilingan LINC0020558,59,60 chiqarib tashlandi (log2 (qatlam o'zgarishi) <-0,58, p-qiymati <0,05), bu skriningning mustahkamligini tasdiqlaydi (1b-rasm). . Linc00205 - 58,59,60 (log2 (↓ ↑), <-0.58, p 值 该 该 可靠性 筛选 可靠性 可靠性 筛选 筛选 筛选 筛选 的 的 的 可靠性 可靠性 可靠性 Linc00205 - 58,59,60 (log2 (↓ ↑), <-0.58, p 值 该 该 可靠性 筛选 可靠性 可靠性 筛选 筛选 筛选 筛选 的 的 的 可靠性 可靠性 可靠性 LINC00205, o kotorom ranee soobshchalos, chto on sposobstvuet progressirovaniyu raka legkix va pecheni58, 59, 60, byl isklyuchen (log2 (kratnoe izmenie) <-0,58, p-znachenie <0,05) 1b). O'pka va jigar saratoni rivojlanishini rag'batlantirish uchun ilgari xabar qilingan LINC0020558,59,60 chiqarib tashlandi (log2 (katlama o'zgarishi) <-0,58, p-qiymati <0,05), bu skriningning mustahkamligini tasdiqlaydi (1b-rasm).
Sinovdan o'tkazilgan barcha lncRNAlar orasida DARS-AS1 ham tekshirildi, uchta qarindosh sgRNA oligonükleotidlari 18 kunlik madaniyatdan so'ng sezilarli darajada kamaydi, bu lncRNKning ishdan chiqishi saraton tarqalishining kamayishiga olib keldi (1b-rasm).Ushbu natija kolorektal saraton hujayralarida MTS tahlili bilan qo'llab-quvvatlandi, bu DARS-AS1 nokdaun hujayralarining o'sish tezligi nazorat hujayralari bilan solishtirganda faqat ikki baravar kamayganligini ko'rsatdi (1c-rasm) va boshqa saraton turlarining oldingi hisobotlariga mos keladi.: aniq hujayrali buyrak saratoni, qalqonsimon bez saratoni va kichik hujayrali o'pka saratoni51,52,53,55.Biroq, uning kolorektal saratondagi funktsiyasi va molekulyar mexanizmlari o'rganilmaganligicha qolmoqda.Shuning uchun biz keyingi o'rganish uchun ushbu lncRNA ni tanladik.
Bemorlarda DARS-AS1 ifodasini o'rganish uchun biz Saraton Genom Atlasi (TCGA) loyihasidan 10 327 o'simta namunasini har tomonlama tahlil qildik.Natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, DARS-AS1 turli xil o'smalarda, jumladan, yo'g'on ichak adenokarsinomasi (COAD), buyrakning ochiq hujayrali karsinomasi (KIRC) va buyrak papiller hujayrali karsinoma (KIRP) kabi sog'lom hujayralarda keng tarqalgan va sezilarli darajada yuqori tartibga solinadi..Juda oz (1d-rasm va qo'shimcha 1a, b). Juftlangan sog'lom/o'simta namunalarini tahlil qilish DARS-AS1 ning siydik pufagi urotelial karsinomasi (BLCA), buyrakning tiniq hujayrali karsinomasi (KIRC), prostata adenokarsinomasi (PRAD), o'pka skuamoz hujayrali karsinomasi (LUSC) o'smalarida sezilarli darajada yuqori ekanligini tasdiqladi. , bachadon korpusining endometrial karsinomasi (UCEC), o'pka adenokarsinomasi (LUAD), jigar gepatotsellyulyar karsinomasi (LIHC), buyrak buyrak papiller hujayrali karsinomasi (KIRP) va yo'g'on ichak adenokarsinomasi (COAD) (p qiymati <0,05) (1e-m-rasm) . Juftlangan sog'lom/o'simta namunalarini tahlil qilish DARS-AS1 ning siydik pufagi urotelial karsinomasi (BLCA), buyrakning tiniq hujayrali karsinomasi (KIRC), prostata adenokarsinomasi (PRAD), o'pka skuamoz hujayrali karsinomasi (LUSC) o'smalarida sezilarli darajada yuqori ekanligini tasdiqladi. , bachadon korpusining endometrial karsinomasi (UCEC), o'pka adenokarsinomasi (LUAD), jigar gepatotsellyulyar karsinomasi (LIHC), buyrak buyrak papiller hujayrali karsinomasi (KIRP) va yo'g'on ichak adenokarsinomasi (COAD) (p qiymati <0,05) (1e-m-rasm) .Juftlangan sog'lom/o'sma namunalari tahlili, shuningdek, siydik pufagi urotelial karsinomasi (BLCA), aniq hujayrali buyrak va buyrak hujayrali karsinomasi (KIRC), prostata adenokarsinomasi (PRAD), o'pka skuamoz hujayrali karsinoma (LUSC) o'smalarida DARS-AS1 ning sezilarli darajada yuqori ifodalanganligini tasdiqladi., kartsinoma endometriya tela matki (UCEC), adenokartsinoma legkogo (LUAD), gepatosellyulyarnaya kartsinoma pecheni (LIHC), papillyarno-kletochnaya kartsinoma pochki (KIRP) va adenokartsinoma to'lstoy kishki (COAD) (znachenie p <0,01e) m). , korpus bachadonining endometrial karsinomasi (UCEC), o'pka adenokarsinomasi (LUAD), jigarning gepatotsellyulyar karsinomasi (LIHC), buyrakning papiller hujayrali karsinomasi (KIRP) va yo'g'on ichakning adenokarsinomasi (COAD) (p qiymati << 0,05) (1e- m-rasm) .配对 健康 / 健康 了 了 了 了 了 了 了 了 上 皮癌 皮癌 上 皮癌 上 皮癌 皮癌 膀胱 膀胱 膀胱 膀胱 膀胱 膀胱 ↑, ↑ 肾 肾 透明 ↑, ↑ ① ② ③, 子宫体子宫 内膜 内膜 (UCEC), 肺腺癌 (Luad), 肝肝 细胞癌 (Luad), 肾 肾 乳头状 细胞癌 细胞癌 (Kirp) 和结肠腺癌 (COAD) <0,05）（1e-m） .① ② ③ ④ nuí ③ sh York-OS1 尿路 尿路 尿路 尿路 尿路 皮癌 肾 肾 肾 肾 肾 肾 细胞癌 ↑, (Prand) (LACS) ↓ ↑, ↑, ↑ ((liad) 肝肝 (LUD) 肝肝 肾 肾 肾 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 细胞（kirp）（koad） （p （<0,05）（1e-m） .Sog'lom / o'simta juftlashtirilgan namunalarni tahlil qilish DARS-AS1 ning siydik pufagi urotelial karsinomasi (BLCA), aniq hujayrali buyrak hujayrali karsinomasi (KIRC), prostata adenokarsinomasi (PRAD) va o'pka skuamoz hujayrali karsinoma (LUSC) o'smalarida rolini qo'llab-quvvatladi.ekspressiya pri kartsinome tela matki (UCEC), adenokartsinome legkogo (LUAD), gepatosellyulyarnoy karsinom (LIHC), pochechno-pochechnoy papillyarno-kletochnoy kartsinome (KIRP) va adenokartsinome tolstoy kishki (COAD) (0,znachenie) <0,. -m). sariq bachadon karsinomasida (UCEC), o'pka adenokarsinomasida (LUAD), gepatotsellyulyar karsinomada (LIHC), buyrak papiller hujayrali karsinomada (KIRP) va yo'g'on ichak adenokarsinomasida (COAD) ifoda (p qiymati <0,05) (1e -m-rasm).Birgalikda olingan bu natijalar DARS-AS1 turli xil saratonlarda keng va yuqori darajada ifodalanganligini ko'rsatadi.
DARS-AS1 va DARS (antisens zanjirini kodlovchi gen) bir xil promouterni baham ko'rishi va bir-birining yonida joylashganligi sababli, biz DARS-ni emas, balki DARS-AS1 ni sindirish uchun shRNKni ishlab chiqdik (Qo'shimcha rasm 2a,b va 2-jadval). .SW620 ga qo'shimcha ravishda, biz DARS-AS1 ni yuqori darajada ifodalovchi uchta boshqa hujayra qatorlaridan shRNKni nokdaun qilishning samaradorligi va funktsiyasini o'rganish uchun foydalandik (3-jadval).Natijalarimiz shuni ko'rsatdiki, ishlab chiqilgan uchta shRNK kamida 80% DARS-AS1 ishdan chiqishi samaradorligiga erishgan va DARS mRNK miqdoriga ozgina ta'sir qilgan (Qo'shimcha rasm 2c-f).Bundan tashqari, biz ushbu shRNAlar bilan DARS-AS1ni nokdaun qilish SW620 (49,7%) va HCT116 (27,7%), ko'krak saratoni hujayra liniyasi MBA-MD-231 (53,4%) yo'g'on ichak saratoni hujayralarida hujayra o'sishini sezilarli darajada inhibe qilganligini aniqladik.) va HepG2 gepatom hujayra chizig'i (92,7% qisqarishi), shuningdek, ularning ankorsiz sharlar hosil qilish qobiliyati (har bir hujayra chizig'iga o'rtacha 50,8%, 44,6%, 40,7% va 75,7% qisqarish) (2a,b-rasm).SW620 da koloniya shakllanishi tahlili natijalari DARS-AS1 shRNK hujayra proliferatsiyasini sezilarli darajada inhibe qilganligini, o'rtacha 69,6% ga o'rtacha pasayishini tasdiqladi (2c-rasm).
Nazorat shRNA va DARS-AS1 shRNA ning SW620, HCT116, MBA-MD-231 va HepG2 hujayralarida hujayra proliferatsiyasi (a) va sferoid shakllanishi (b) ga ta'siri.c SW620 hujayralarida koloniya shakllanishiga nazorat shRNA va DARS-AS1 shRNA ta'siri.DARS-AS1 ni haddan tashqari ifodalovchi SW620 hujayralarining hujayra proliferatsiyasi (d), sferoid shakllanishi (e) va koloniya shakllanishi (f).Ko'rsatilgan ma'lumotlar uchta tajribaning o'rtacha ± standart og'ishidir.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 va *** p ≤ 0,001 ikki dumli Student t-testi orqali.
Funktsiyani yo'qotish bo'yicha tadqiqotlarni to'ldirish uchun biz DARS-AS1 ni haddan tashqari ifodalovchi SW620 hujayralarini yaratdik (Qo'shimcha rasm 2g).DARS-AS1 haddan tashqari ekspressiyasi SW620 hujayralarida hujayra o'sishini (1,8 barobar), ankorsiz sferoid shakllanishini (1,4 barobar) va koloniya shakllanishini (3,3 barobar) sezilarli darajada oshirdi (2d-f-rasm).Biz bu natijani boshqa DARS-AS1 ifodalovchi hujayra liniyasi A549 yordamida tasdiqladik.DARS-AS1 haddan tashqari ekspressiyasi tufayli hujayra proliferatsiyasining kuchayishi A549 hujayralarida ham kuzatildi (Qo'shimcha 2h-rasm, i va qo'shimcha jadval 3).Birgalikda olingan ushbu daromad va yo'qotish tadqiqotlari DARS-AS1 in vitro saraton hujayralarining ko'payishiga yordam berishini ko'rsatadi.
DARS-AS1 hujayra proliferatsiyasini tartibga soluvchi asosiy mexanizmni o'rganish uchun biz uning potentsial oqsilni bog'laydigan sheriklarini aniqlash uchun RNKni pastga tushirish tahlilini o'tkazdik.RT-qPCR natijalari DARS-AS1 ning taxminan 86,2% SW620 hujayralari sitoplazmasida joylashganligini ko'rsatdi (Qo'shimcha rasm 3a).In vitro transkripsiyalangan biotinillangan DARS-AS1 yoki psevdoRNK keyin SW620 hujayra lizatlari bilan inkubatsiya qilindi, so'ngra SDS-PAGE ajratildi.Keyinchalik kumush bo'yash shuni ko'rsatdiki, aniq tasma (~ 38 kDa) DARS-AS1 tortish namunalarida sezilarli darajada boyitilgan, ammo qo'g'irchoq RNK yoki boncuk namunalarida emas (3a-rasm).Ushbu tarmoqli massa spektrometriyasi (MS) orqali PKR faollashtiruvchi oqsil (PACT) sifatida aniqlandi va SW620, HCT116 va HepG2 hujayra liniyalarida immunoblotting bilan tasdiqlandi (3a,b-rasm).DARS va tegishli PACT oqsillarini boyitish - PKR va TRBP - Western blotting (WB) tomonidan RNK tahlili yordamida ham tekshirildi.Natijalar shuni ko'rsatdiki, DARS-AS1 RNK va ushbu uchta oqsil o'rtasida to'g'ridan-to'g'ri ta'sir o'tkazilmagan (Qo'shimcha rasm 3b).DARS-AS1 va PACT o'rtasidagi o'ziga xos o'zaro ta'sir RNK immunoprecipitation (RIP) tahlili bilan tasdiqlandi, bu DARS-AS1 anti-PACT antikorlarida sezilarli darajada boyitilganligini, ammo boshqa nazorat RNKlarida emasligini ko'rsatdi (3c-rasm).DARS-AS1 ning boshqa uyali komponentlar yo'qligida to'g'ridan-to'g'ri PACT bilan o'zaro ta'sir qilishini aniqlash uchun tozalangan PACT yordamida in vitro biolayer interferometriyasi (BLI) tahlili o'tkazildi.Biotin bilan belgilangan DARS-AS1 yoki qo'g'irchoq RNK streptavidin (SA) biosensorlarida immobilizatsiya qilindi va keyin 1 mkM PACT o'z ichiga olgan kinetik buferda inkubatsiya qilindi.Shunisi e'tiborga loyiqki, PACT DARS-AS1 (KD qiymati ~ 26,9 nM) ga qattiq bog'langan, lekin RNKni taqlid qilmaydi (3d-rasm).Birgalikda bu natijalar DARS-AS1 va PACT o'rtasidagi to'g'ridan-to'g'ri o'zaro ta'sir va yuqori yaqinlikni namoyish etadi.
RNKni tortib olish tahlili DARS-AS1ni SW620 hujayralarida PACT bilan o'zaro ta'sirini aniqladi.Yuqorida, tegishli oqsillarni kumush bo'yash.Pastki immunoblotlar anti-PACT antikorlari bilan amalga oshirildi.b RNKni pastga tushirish tahlili HCT116 (yuqori) va HepG2 (pastki) hujayralarida o'tkazildi.PACTni boyitish immunoblotting orqali aniqlandi.cRNK immunoprecipitation (RIP) tahlillari ko'rsatilgan antikorlar yordamida SW620 hujayralarida o'tkazildi.d Biolayer interferometriya (BLI) yordamida to'liq uzunlikdagi DARS-AS1 yoki nazorat RNKga PACT bog'lovchi egri chiziqlari olingan.RNK streptavidin biosensorida immobilizatsiya qilindi.Assotsiatsiyani o'lchash uchun 1 mkM PACT ishlatilgan.e RNKni tortib olish tahlili biotinlangan to'liq uzunlikdagi DARS-AS1 yoki kesilgan (yuqori) yordamida amalga oshirildi.Qabul qilingan PACTni ko'rsatadigan immunoblot (pastki).f Tozalangan bayroqli PACT biotinillangan to'liq uzunlikdagi DARS-AS1 bilan inkubatsiya qilingan yoki in vitro RIP tahlili uchun kesilgan (e'dagi kabi).Chiqarilgan RNK RT-qPCR tomonidan tekshirildi.g PACT uchun turli RNK fragmentlarining nisbiy yaqinligi biolayer interferometriyasi yordamida olingan.Tahlil qilish uchun 100 nM RNK va 1 mkM RAST ishlatilgan.h In vitro RIP tahlillari tozalangan buzilmagan yoki kesilgan etiketli PACT yordamida amalga oshirildi.Chiqarilgan RNK RT-qPCR tomonidan tekshirildi.i DARS-AS1, PACT yoki ikkalasini haddan tashqari ifodalovchi SW620 hujayralarining o'sish tezligi.j SW620 hujayralarida to'liq uzunlikdagi yoki kesilgan DARS-AS1 ning ortiqcha ifodalanishi hujayra o'sishiga turli xil ta'sir ko'rsatdi.k Apoptoz anti-PARP antikori bilan immunoblotting orqali aniqlandi.l DARS-AS1 nokauti oqim sitometriyasida ko'rsatilganidek, SW620 hujayralarining apoptozini keltirib chiqaradi.Ko'rsatilgan ma'lumotlar uchta tajribaning o'rtacha ± standart og'ishidir. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001, ikki dumli Student t testi bilan. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001, ikki dumli Student t testi bilan. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 po dvustoronnemu kriteriyu Styudenta. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 ikki dumli Student t-testi bilan. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，p ≤ 0,05, **p ≤ 0,001 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，p ≤ 0,05, **p ≤ 0,001 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 po dvustoronnemu kriteriyu Styudenta. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 ikki dumli Student t-testi bilan.
Keyin biz PACT assotsiatsiyasi uchun zarur bo'lgan DARS-AS1 hududini aniqlash uchun in vitro transkripsiyasi orqali uchta biotinlangan DARS-AS1 RNK fragmentlarini yaratdik (3e-rasm).RNK tahlili natijalari shuni ko'rsatdiki, har bir fragment PACT bilan o'zaro ta'sir o'tkazishga qodir, ammo 3'-terminal mintaqasi (A3 etiketli 384-768 nukleotid) A1 bilan belgilangan 1-384 dan ortiq nukleotidlarni ko'rsatdi (3e-rasm).Shunga o'xshash natijalar rekombinant PACT yordamida in vitro RIP tahlilida kuzatildi (3f-rasm).Ushbu natijalarga muvofiq, BLI yordamida immobilizatsiyalangan RNK fragmentlarini PACT bilan bog'lash bo'yicha tajribalar, shuningdek, PACT A3 (384-768 nt) (KD qiymati taxminan 94,6 nM) uchun yuqori yaqinlikka ega ekanligini va boshqa sohalar bilan deyarli aloqasi yo'qligini ko'rsatdi.(3d-rasm).
Shuningdek, biz PACTda bog'langan bog'lovchi hududlarni ko'rib chiqdik.PACT uchta funktsional domenni o'z ichiga oladi, ulardan ikkitasi saqlanib qolgan ikki zanjirli RNK-bog'lovchi domenlar (dsRBD) va uchinchi domen (belgilangan D3) oqsil o'zaro ta'sirini faollashtiruvchisi sifatida ishlaydi.Har bir domenning lncRNA bog'lanish qobiliyatini tekshirish uchun biz uchta mutatsiyani ishlab chiqdik, ular uchta domenning har birini olib tashladik va in vitro RIP tahlilini o'tkazdik.Bizning natijalarimiz shuni ko'rsatdiki, PACTning uchinchi domenini (D3) o'chirish uning DARS-AS1 bilan o'zaro ta'sirini (buzilmagan PACT bilan solishtirganda 0,11 marta) boshqa ikkita mutatsiyaga (3h-rasm) nisbatan sezilarli darajada kamaytirdi, bu chiqarilishi ko'rsatilgan. D3 ning DARS bilan o'zaro ta'siri.-AC1.Birgalikda bu natijalar shuni ko'rsatadiki, DARS-AS1 va PACT o'rtasidagi o'zaro ta'sir asosan DARS-AS1 ning 3' uchi va PACTning D3 domeni orqali sodir bo'lishi mumkin.
Biz DARS-AS1 ning PACT ifodasiga ta'siri yo'qligini va PACT DARS-AS1 ga ta'sir qilmaganligini ta'kidladik (Qo'shimcha rasm 3c).Keyin biz PACT nokdaunining hujayra o'sishiga ta'sirini ko'rib chiqdik.DARS-AS1 dan farqli o'laroq, PACT yiqilganda nisbiy hujayralar 1,5-3 baravar tezroq o'sdi (Qo'shimcha rasm 3d).Koloniya shakllanishi tahlili natijalari shuni ko'rsatdiki, hujayralar PACT bilan shRNK bilan ishlov berilgandan so'ng 2-3 marta koloniyalar hosil qilgan (Qo'shimcha rasm 3e).DARS-AS1 PACT orqali hujayra proliferatsiyasini tartibga soladimi yoki yo'qligini tekshirish uchun biz PACT, DARS-AS1 yoki ikkalasini haddan tashqari ifodalovchi SW620 hujayralarini yaratdik.PACT ning haddan tashqari ko'payishi hujayra proliferatsiyasini sezilarli darajada inhibe qilganligini ko'rsatdi (3i-rasm).DARS-AS1 haddan tashqari ifodalanishi hujayra proliferatsiyasini sezilarli darajada rag'batlantirgan bo'lsa-da, DARS-AS1 va PACTni haddan tashqari ifodalovchi hujayralarning o'sish tezligida sezilarli farq yo'q edi.Ushbu natijalar PACT DARS-AS1 haddan tashqari ko'payishi natijasida ko'paygan proliferatsiyaga qarshi turishi mumkinligini ko'rsatadi.
DARS-AS1 ning turli hududlari turli xil PACT-bog'lash qobiliyatiga ega bo'lganligi sababli, biz DARS-AS1 fragmentlarining turli xil haddan tashqari ifodalanishi orqali ularning hujayra proliferatsiyasiga nisbatan ta'sirini o'rganib chiqdik.Boshqa ikkita fragment bilan solishtirganda, DARS-AS1 hujayra proliferatsiyasini rag'batlantirishning eng yuqori qobiliyatiga ega bo'lgan DARS-AS1 da PACT bilan bog'liq asosiy hudud bo'lgan 3' oxirida (384-768 nt) haddan tashqari ifodalangan (3j-rasm).Ushbu natijalar DARS-AS1 ning bog'lanish qobiliyati va biologik funktsiyasi o'rtasidagi ijobiy korrelyatsiyani ko'rsatadi.
PACT proapoptotik oqsil ekanligi xabar qilingan19.Shuning uchun biz DARS-AS1 ning apoptozga ta'sirini tekshirdik.Kutilganidek, DARS-AS1 yiqitishi SW620 hujayralarida PARP parchalanishini sezilarli darajada oshirdi va SW620, HCT116, HepG2 va MBA-MD-231 hujayra liniyalarida anneksin V-musbat hujayralar ulushini oshirdi (3k-rasm).3).3f-h), saraton hujayralarida DARS-AS1 ning anti-apoptotik ta'siri PACT ning apoptozni qo'zg'atuvchi funktsiyasiga qarama-qarshi ekanligini ko'rsatadi.Birgalikda bu natijalar DARS-AS1 onkogen funktsiyasi mexanizmi PACT funktsiyasini inhibe qilish orqali bo'lishi mumkinligini ko'rsatadi.
Keyinchalik, biz DARS-AS1-PACT assotsiatsiyasining funktsional oqibatlarini o'rganib chiqdik.PACT to'g'ridan-to'g'ri o'zaro ta'sir orqali PKRni faollashtirishi haqida xabar berilgan, bu esa keyinchalik eIF2a fosforillanishini kuchaytiradi, translatsiyani yo'q qilish va apoptozni keltirib chiqaradi17.Birinchidan, biz DARS-AS1 PACT va PKR ning uyali lokalizatsiyasiga ta'sir qiladimi yoki yo'qligini tekshirdik.Konfokal floresan mikroskopiya PACT va PKR ning o'rtacha Pearson korrelyatsiya koeffitsienti 0,72 bo'lgan SW620 hujayralarida yuqori darajada kolokalizatsiya qilinganligini ko'rsatdi.Ayni paytda, DARS-AS1 haddan tashqari ifodasi PACT va PKR birgalikda lokalizatsiyasini sezilarli darajada kamaytirdi (o'rtacha Pearson korrelyatsiya koeffitsienti 0,61) (4a-rasm).DARS-AS1 PACT-PKR o'zaro ta'sirini modulyatsiya qila oladimi yoki yo'qligini tekshirish uchun biz SW620 hujayra lizatlarida anti-PACT antikori bilan birgalikda immunopresipitatsiya (ko-IP) tahlilini o'tkazdik.PKR nazorat hujayralarida anti-PACT bilan yuqori darajada boyitilgan, PKRning tiklanishi esa DARS-AS1 ni haddan tashqari ko'rsatadigan hujayralardagi lizatlarda sezilarli darajada kamaydi (4b-rasm).Tozalangan etiketli PACT va PKR in vitro oqsillarni bog'lash tahlillari uchun ishlatilgan.Shunga ko'ra, DARS-AS1 ni ta'minlagan, ammo nazorat qiluvchi RNK bo'lmaganlar bostirilgan PACT-PKR o'zaro ta'sirini ko'rsatdi (4c-rasm).Barcha natijalar DARS-AS1 PACT va PKR aloqasini buzganligini ko'rsatdi.
PACT va PKR ning nazorat hujayralarida yoki DARS-AS1 ni haddan tashqari ifodalovchi hujayralarda birgalikda lokalizatsiyasi konfokal floresan mikroskop yordamida kuzatildi.Yadrolar DAPI bilan bo'yalgan.Statistik natijalar 16 ta fotosuratdan olingan.b Nazorat qiluvchi SW620 hujayralari yoki DARS-AS1 ni haddan tashqari ifodalovchi hujayralarning hujayra lizatlarida anti-PACT antikorlari yordamida birgalikda immunoprecipitatsiya (ko-IP).c etiketli PACT, tozalangan PKR va DARS-AS1 yoki soxta RNK bilan in vitro transkripsiyasi in vitro oqsillarni ulash tahlili uchun inkubatsiya qilindi.Immunopresipitatsiya uchun bayroqqa qarshi antikorlar ishlatilgan.d Ko'rsatilgan antikorlar bilan immunoblotlar nazorat shRNA yoki DARS-AS1-shRNA bilan transfektsiyalangan SW620 va HCT116 hujayralarida amalga oshirildi, so'ngra sarum ochligi kuzatildi.e DARS-AS1 ifoda darajalari thapsigarginga hujayra sezgirligini o'zgartirdi.SW620 xujayralari DARS-AS1 shRNK, DARS-AS1 haddan tashqari ekspression plazmidi yoki nazorat plazmidi bilan transfektsiya qilindi.Hujayralar 48 soat davomida thapsigargin bilan ishlov berildi va hujayra hayotiyligi MTS reaktivi yordamida aniqlandi.f In vitro transkripsiyalangan DARS-AS1 yoki qo'g'irchoq RNK va tozalangan PACT in vitro faollashuv tahlili va immunoblotni aniqlash uchun ishlatilgan.g Ushbu antikorlardan foydalangan holda immunoblotlar SW620-ctrl hujayralarida (chapda) yoki PKR mutantlarini haddan tashqari ifodalovchi hujayralarda (o'ngda) amalga oshirildi.Keyin bu hujayralar nazorat shRNA yoki DARS-AS1-shRNA bilan transfektsiya qilindi, so'ngra sarum ochligi kuzatildi.h Oqim sitometriyasi mutant PKR ning inaktivatsiyasi SW620 hujayralarida DARS-AS1 tomonidan qo'zg'atilgan apoptozni kompensatsiya qilishini ko'rsatdi.i Ko'rsatilgan antikorlar bilan immunoblotlar SW620 (chapda) yoki HCT116 (o'ngda) hujayralarida amalga oshirildi.Nazorat qiluvchi shRNK yoki DARS-AS1 shRNK bilan transfektsiyalangan hujayralar sarumdan mahrum va 100 nM PKR C16 inhibitori yoki DMSO bilan to'ldiriladi.O'lchov paneli = 5 mikron.Ko'rsatilgan ma'lumotlar uchta tajribaning o'rtacha ± standart og'ishidir.* p ≤ 0,05 ikki dumli Student t-testi.
Odatda PACT PKR17 bilan o'zaro ta'sir qilgandan so'ng, Thr451da PKR fosforillanishini induktsiya qilish mumkin deb ishoniladi.Natijalarimiz shuni ko'rsatdiki, PKR fosforillanish darajasi sarum ochligidan keyin DARS-AS1 yiqitilgan hujayralarda sezilarli darajada oshgan (4d-rasm va qo'shimcha rasm 4a).Shunga ko'ra, biz asosiy PKR substrati bo'lgan eIF2a ning fosforillanishi DARS-AS1 shRNK tomonidan ham sezilarli darajada oshganligini aniqladik (4d-rasm va qo'shimcha 4a-rasm).Thapsigargin - bu ERning Ca2 + ni chiqarishiga olib keladigan ER stressoridir.Thapsigargin bilan davolash PACT ning ifodalanishi va faollashishini keltirib chiqarishi haqida xabar berilgan, bu esa PKR bilan yanada o'zaro ta'sir qiladi va faollashtiradi, bu eIF2a fosforillanishini oshirish orqali apoptozga olib keladi 18,61.Bu erda biz DARS-AS1 hujayralarga PACT/PKR yo'lini inhibe qilish orqali stressni engishga yordam berishi mumkinligini tekshirish uchun PACT / PKR yo'lining stimulyatori sifatida thapsigargindan foydalandik.Biz DARS-AS1 ifodasi darajasi thapsigarginga hujayra qarshiligi bilan ijobiy bog'liqligini kuzatdik.DARS-AS1 ni haddan tashqari ifodalovchi SW620 xujayralari thapsigargin bilan davolashda yaxshiroq omon qoldi, DARS-AS1 yiqitilgan hujayralar esa sezgir bo'lib qoldi (4e-rasm).Ushbu natijalarga muvofiq, DARS-AS1 haddan tashqari ekspressiyasi tapsigargin tomonidan qo'zg'atilgan PKR fosforillanishini kamaytirdi (Qo'shimcha rasm 4b).Aksincha, thapsigargin bilan davolashdan so'ng, PKR va eIF2a nazorat hujayralariga nisbatan DARS-AS1 yiqitma hujayralarida yuqori darajada fosforlangan (Qo'shimcha rasm. 4b).Qizig'i shundaki, tapsigargin DARS-AS1 ifodasini dozaga bog'liq holda qo'zg'atdi, bu DARS-AS1 ning stressga qarshi funktsiyasini ko'rsatishi mumkin (Qo'shimcha rasm 4c).Bundan tashqari, biz ushbu kuzatishlarni tasdiqlash uchun in vitro faollashtirish tahlillarini o'tkazdik.Qisqacha aytganda, PKR anti-PKR antikori yordamida hujayra lizatlaridan tozalangan, so'ngra rekombinant PACT va in vitro transkripsiyalangan DARS-AS1 bilan inkubatsiya qilingan.Enzimatik reaksiyadan so'ng WB yordamida fosfo-PKR aniqlandi.Natijalarimiz PKR fosforillanishi DARS-AS1 tomonidan sezilarli darajada inhibe qilinganligini, ammo nazorat RNK tomonidan emasligini ko'rsatdi (4f-rasm).Ushbu in vitro va in vivo natijalar DARS-AS1 PACT vositachiligida PKR faollashuvini inhibe qilishini ko'rsatadi.Shu bilan birga, biz DARS-AS1 mavjudligida PACT tiklanishining pasayishini ham kuzatdik (4f-rasm).Bu natija in vitro oqsillarni bog'lash tahlili natijalariga mos keladi (4c-rasm) va yana PACT-PKR assotsiatsiyasi uchun DARS-AS1 blokirovkalash funktsiyasini ko'rsatadi.
PACT ning D3 domenidagi Ser246 va Ser287 uyali stress ostida PKR faollashishi uchun talab qilinadi.Alanin uchun ikkita serin qoldiqlarini almashtirish mutant PACT (mutD) ni berdi, bu stress bo'lmaganda PKRni faollashtirdi va alanin (mutA) ni almashtirish protokolni o'zgartirdi.Biz ushbu domenning DARS-AS1 bilan bevosita bog'liqligi muhimligini ko'rsatganimiz sababli, biz ushbu qoldiqlarning DARS-AS1 bilan o'zaro ta'sirida ishtirok etishi mumkinligini tekshirish uchun ushbu ikkita PACT mutantini yaratdik.Qizig'i shundaki, ikkala mutant DARS-AS1 bilan bog'lanish qobiliyatini yo'qotdi (Qo'shimcha rasm. 4d), bu DARS-AS1 bilan samarali o'zaro ta'sir qilish uchun PACT oqsilining to'liq tuzilishi talab qilinishi mumkinligini ko'rsatadi.
Bundan tashqari, bizning natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, DARS-AS1-shRNA tomonidan induktsiya qilingan hujayra proliferatsiyasining inhibisyonu dominant salbiy PACT mutantini (PACTmutA) yoki dominant salbiy PKR mutantini (PKRmut) haddan tashqari ifodalash orqali qisman tiklanishi mumkin (Qo'shimcha rasm. 4e. e).Dominant-salbiy PKR mutantlarining haddan tashqari ekspressiyasi DARS-AS1 yiqilishiga olib keladigan PKR fosforillanishini, shuningdek, sarumdan mahrum bo'lgan hujayralardagi eIF2a fosforilatsiyasini kamaytirdi (4g-rasm).Eng muhimi, PKRmutni haddan tashqari ifodalovchi hujayralarda DARS-AS1 nokdatu natijasida kelib chiqqan apoptotik hujayralar ulushi ham kamaydi (4h-rasm va qo'shimcha 4g).PKR kinaz faolligini inhibe qilish DARS-AS1 funktsiyasini ham buzadi, chunki natijalar hujayralarga PKR-ga xos C16 inhibitori bilan ishlov berilganda DARS-AS1 ishdan chiqishi kamdan-kam hollarda PKR va eIF2a fosforillanishini qo'zg'atganini ko'rsatdi (4i-rasm va qo'shimcha rasm. 4h).).Birgalikda olingan natijalar shuni ko'rsatadiki, DARS-AS1 PACT vositachiligida PKR faollashuvini inhibe qilish orqali hech bo'lmaganda qisman hujayra proliferatsiyasiga yordam beradi.
DARS-AS1 ning shish paydo bo'lishidagi rolini yanada o'rganish uchun biz sichqonchaning ksenograft modelidan foydalangan holda in vivo tajribalar o'tkazdik. Natijalar shuni ko'rsatadiki, DARS-AS1 ning ishdan chiqishi sichqonlarda o'simta o'sishini keskin kamaytirdi (p qiymati <0,0001) (5a-rasm). Natijalar shuni ko'rsatadiki, DARS-AS1 ning ishdan chiqishi sichqonlarda o'simta o'sishini keskin kamaytirdi (p qiymati <0,0001) (5a-rasm). Rezultaty pokazyvayut, chto nokdaun DARS-AS1 rezko snijaet rost opuxoli u myshey (znachenie p <0,0001) (ris. 5a). Natijalar shuni ko'rsatadiki, DARS-AS1 nokauti sichqonlarda o'simta o'sishini keskin kamaytiradi (p qiymati <0,0001) (5a-rasm).结果 表明, DARS-AS1 ー ↑ (<0.0001) (p 值 <0.0001) (图 5A).DARS-AS1 língíngíngíngíngíngíngíngjíngíngíngíngíngíngjíníngjíníngíníngíníngíníngíníngíníngíníngíníngíníngínčičičnjīngčičiż (pkĀ<0.0001）（5a） Rezultaty pokazali, chto nokdaun DARS-AS1 znachitelno snijaet rost opuxoli u myshey (znachenie r <0,0001) (ris. 5a). Natijalar shuni ko'rsatdiki, DARS-AS1 ishdan chiqishi sichqonlarda o'simta o'sishini sezilarli darajada kamaytirdi (p qiymati <0,0001) (5a-rasm).Shunday qilib, DARS-AS1 nokdaun guruhida o'smaning o'rtacha hajmining taxminan 72,9% ga va o'rtacha o'simta massasining taxminan 87,8% ga sezilarli darajada pasayishi kuzatildi (5b-d-rasm).Ushbu natijalar DARS-AS1 in vivo jonli ravishda o'simta o'sishini sezilarli darajada oshirishi mumkinligini aniq ko'rsatmoqda.
Yalang'och sichqonlarda kolorektal onkogenezga DARS-AS1 reklamasining ta'siri.O'sish egri chiziqlari (a), o'simta kattaligi (b), vazn (c) va o'simta tasvirlari (d) ko'rsatilgan.Xato satrlari ±SEMni ifodalaydi. n = 10. ****p < 0,0001, ikki dumli Student t testi bo'yicha. n = 10. ****p < 0,0001, ikki dumli Student t testi bo'yicha. n = 10. ****p < 0,0001 bo'yicha dvustoronnemu kriteriyu Styudenta. n = 10. ****p < 0,0001 ikki dumli Student t-testi.n = 10. ****p < 0,0001， língīngjīngjīngjīng. ****p < 0,0001，làngāngāngāngāngīngīng. ****p < 0,0001 bo'yicha dvustoronnemu kriteriyu Styudenta. ****p <0,0001 ikki dumli Student t-testi.e Kaplan-Meier UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM va LGG bilan og'rigan bemorlarda DARS-AS1 ifoda darajalari va umumiy omon qolish o'rtasidagi korrelyatsiyani tahlil qildi.Bemorlarda yuqori darajadagi DARS-AS1 ifodasi eng yuqori 50% ni tashkil etdi;bemorlarda DARS-AS1 ifodasining past darajasi pastki 50% edi.p-qiymatlari log rank testi yordamida aniqlandi.f DARS-AS1 PACT-PKR yo'lini va o'simta o'sishini tartibga soluvchi taklif qilingan model.
DARS-AS1 ning klinik ta'sirini yaxshiroq tushunish uchun biz uning ifodasi va bemorning omon qolishi o'rtasidagi bog'liqlikni ko'rib chiqdik.TCGA ma'lumotlar to'plamini tahlil qilib, biz yuqori DARS-AS1 ifodasi uveal melanoma (UVM), buyrak xromofobiyasi (KICH), buyrak papiller hujayrali karsinoma (KIRP), mezotelioma (MESO), multipleks bilan bog'liqligini aniqladik.Pastroq omon qolish glioblastoma morfozi (GBM) va past darajadagi miya gliomasi (LGG) bo'lgan bemorlar bilan sezilarli darajada bog'liq edi (5e-rasm).Ushbu natijalar DARS-AS1 o'simtaning klinik rivojlanishida muhim rol o'ynashi va bir nechta saraton kasalliklarida potentsial bashorat qiluvchi biomarker bo'lishi mumkinligini ko'rsatadi.
Ushbu tadqiqotda keng ko'lamli CRISPRi funktsional skrining yordamida biz DARS-AS1 lncRNA ikkita asosiy stressga javob beruvchi PACT va PKRni tartibga solish orqali saraton hujayralari stressini engishini aniqladik.To'g'ridan-to'g'ri PACT bilan o'zaro ta'sir qilish orqali DARS-AS1 PACT vositachiligida PKR faollashuvini inhibe qildi, shu bilan apoptotik hujayra o'limini oldini oladi va hujayra proliferatsiyasini rag'batlantiradi (5f-rasm).DARS-AS1 ning ko'tarilishi saratonning ko'plab turlarida kuzatilgan, bu uning stressli sharoitlarda saraton hujayralarining omon qolishiga yordam berish funktsiyasi saratonning ko'p turlariga keng qo'llanilishi mumkinligini ko'rsatadi.
PACT PKR faollashtiruvchi oqsil sifatida aniqlangan va PACT vositachiligidagi PKR faollashuvi transkripsiya, translatsiya, apoptoz va boshqa muhim hujayra jarayonlarini tartibga solish orqali stress reaktsiyalarida muhim rol o'ynaydi62.O'nlab yillar davomida PACT-PKR kaskadining saratonga xos regulyatsiyasini tushunishga urinishlar qilingan.Bu erda bizning tadqiqotimiz PACT-ga to'g'ridan-to'g'ri bog'langan, PACT-PKR o'zaro ta'sirini bloklaydigan, PKR faollashuvini va eIF2a fosforillanishini inhibe qiluvchi, shu bilan stressdan kelib chiqqan apoptozni inhibe qiluvchi hujayrali lncRNA DARS-AS1 orqali saraton hujayralarida PACT-PKR ni tartibga solishning boshqa mexanizmini aniqladi. saratonning yakuniy tarqalishini rag'batlantirish.hujayralar.Ushbu kashfiyot saraton prognozi va terapiyasi uchun potentsial lncRNA maqsadlariga oydinlik kiritadi.
Bizning ma'lumotlarimiz shuni ko'rsatdiki, DARS-AS1 ishdan chiqishi hujayralarni fosforlangan PKR va eIF2a ning sezilarli darajada oshishi bilan qon zardobidagi ochlikka sezgir qiladi.Ushbu natijalar DARS-AS1 PACT/PKR faolligini inhibe qilish orqali og'ir sharoitlarda saraton hujayralarining omon qolishiga yordam beradi.ASPACT va nc886 kabi bir qancha boshqa kodlanmagan RNKlar ham PACT/PKR o'qida PACT48 mRNKni pastga regulyatsiya qilish yoki PKR49,50,64 bilan bog'lanish orqali avtofosforillanishni tartibga solish orqali ishtirok etadi.Ular orasida DARS-AS1 PACT-PKR assotsiatsiyasini buzuvchi sifatida ishlaydi.Ushbu tadqiqot PACT/PKR o'qini tartibga solish va lncRNAlarning stressga javob berishdagi roli haqidagi tushunchamizni boyitadi.
PACT uchta alohida domenni o'z ichiga oladi.Birinchi ikkita dsRBDning har biri PACT ning PKR bilan yuqori afinitetli ulanishiga erishish uchun etarli, uchinchi domen (D3) esa PKRni in vitro va in vivo faollashtirish uchun talab qilinadi.Tadqiqotimiz shuni ko'rsatdiki, DARS-AS1 D3 domeni bilan afzalroq o'zaro ta'sir qiladi (3h-rasm).LncRNA (768 nukleotid) ning katta hajmini hisobga olgan holda, DARS-AS1 D3 bilan bog'lanishi dsRBD va PKR ning PACT domenlari o'rtasidagi o'zaro ta'sirni jismoniy ravishda inhibe qilishi mumkin va shu bilan PACT va PKR assotsiatsiyasini bloklaydi.D3 dagi Ser246 va Ser287 ni alanin yoki aspartat bilan almashtirgan PACT nuqta mutatsiyalari uning DARS-AS1 bilan bog'lanish yaqinligini buzdi, bu ularning birlashuvida D3 ning umumiy strukturaviy va elektr xususiyatlarining muhimligini ko'rsatdi.Kelajakda aniqroq biokimyoviy tahlil va yuqori aniqlikdagi PACT strukturaviy tahlilidan foydalangan holda ushbu mexanizmning batafsil ma'lumotlari talab qilinadi.
Oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, DARS-AS1 bir nechta mexanizmlar orqali hujayra proliferatsiyasiga yordam beradi51,52,53.Bir misolda, tergovchilar DARS-AS1 buyrak saratoni hujayralarida miP-194-5p ni nishonga olish orqali antisens protein kodlovchi DARS genini ko'targanini kuzatdilar.Biroq, ushbu tadqiqotda DARS-AS1 nokdatusi saratonning ko'p turlarida, jumladan, hech bo'lmaganda yo'g'on ichak, ko'krak va jigar saratonlarida DARS transkripsiyasiga kam ta'sir ko'rsatdi.LncRNKlar hujayra va to'qimalarga xos ekspressiya naqshlarini namoyish qilganligi sababli, funktsional mexanizmlar saraton turlari bo'yicha saqlanib qolmasligi mumkin, bu bizning kuzatishlarimiz va turli saratonlarning oldingi baholashlari o'rtasidagi tafovutga yordam berishi mumkin.Turli fiziologik va patologik jarayonlarning o'ziga xos mexanizmlarini aniqlash uchun maxsus tadqiqotlar kerak.
Klinik ma'lumotlarning tahlili shuni ko'rsatdiki, o'smalarda DARS-AS1 ifodasi saraton kasalligining omon qolishi bilan teskari bog'liq bo'lib, bu DARS-AS1 / PACT / PKR o'qining saraton prognozidagi ahamiyatini ta'kidlaydi.Xulosa qilib aytganda, bizning tadqiqotimiz shuni ko'rsatadiki, DARS-AS1 PACT / PKR signalizatsiya o'qining regulyatori bo'lib, saraton hujayralarining ko'payishini rag'batlantiradi va stressga javob berish paytida apoptozni inhibe qiladi, bu boshqa tadqiqot yo'nalishini ta'minlaydi va potentsial davolanish bo'yicha kelajakdagi tadqiqotlar uchun qiziqish uyg'otadi. .
Inson hujayra liniyalari SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 va HEK293T Xitoydagi Milliy hujayra liniyasi resurs infratuzilmasidan olingan.Barcha hujayralar 10% FBS (Gemini, Bruklin, NY) va 1% penitsillin-streptomitsin (Termo Fisher Scientific) bilan to'ldirilgan DMEM muhitida (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) 37 ° C, 5% CO2 da saqlangan.inkubator.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (fosfo-T451), Abcam (ab81303);Anti-Flag, Abcam (ab125243);Anti-eIF2a, Abcam (A0764));anti-eIF2a (fosfor S51), Abcam (ab32157);anti-PACT (fosfor S246), Abgent (AP7744b);anti-b-tubulin, CST (2128);oddiy sichqoncha IgG, CST (5415S);oddiy quyon IgG, CST (2729S).Antikorlar Western blot uchun PBSTda 1:1000 va IP uchun 1:100 nisbatda suyultirildi.
sgRNKlar CRISPR-ERA66 deb nomlangan ommaviy vosita yordamida ishlab chiqilgan.Biz sgRNKni ishlab chiqish uchun standart vosita parametrlaridan va 3 kb mintaqadagi sgRNA bog'lanish joylarini hisoblash algoritmidan foydalandik.markazi TSSda.SgRNK oligonükleotidlari hovuzlari CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) da sintez qilingan va insoniylashtirilgan pgRNK plazmidlariga klonlangan (Addgene #44248).Jami 12 mkg birlashtirilgan insoniylashtirilgan pgRNA plazmidi, 7,2 mkg psPAX2 (Addgene #12260) va 4,8 mkg pMD2.G (Addgene #12259) 10 mkg transfektsiyali DNA disfektsiyasi yordamida 5 x 106 HEK293T ga birgalikda transfektsiya qilindi. hujayralar (CWBIO, Pekin, Xitoy) ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq.Virus o'z ichiga olgan supernatantlar transfeksiyadan 48 va 72 soat o'tgach to'plangan va 0,45 mkm filtr orqali filtrlangan.Skrining uchun dCas9/KRAB termoyadroviy oqsilini ifodalovchi SW620 hujayralari virus transduktsiyasi orqali olingan.O'zgartirilgan SW620 xujayralari 0,1-0,3 MOIda to'rtta mustaqil infektsiya tajribalarida virus kutubxonasi bilan zararlangan va 2 kun davomida 2 mg / ml puromisin (Sigma, Sent-Luis, MO) bilan namuna olingan.Shundan so'ng, hujayralar skrining uchun 500 hujayra / sgRNK minimal kutubxona qamrovi bilan in vitro 18 kun davomida ekilgan.
Genomik DNK QIAamp DNK Blood Midi Kit (QIAGEN, Dyusseldorf, Germaniya; 51183) ko'rsatmalariga muvofiq olingan.Kutubxonani qurish uchun jami 100 mkg genomik DNK biologik takrorlash uchun ishlatilgan.SgRNA hududi ikki tur PCR bilan kuchaytirildi va shtrix-kod bilan bog'landi.
PCR mahsulotlari NucleoSpin® gel va PCR tozalash to'plami (MACHEREY-NAGEL, Dyuren, Germaniya; 740609.250) yordamida tozalandi va Qubit™ HS ikki zanjirli DNKni aniqlash to'plami (Thermo Fisher Scientific; Q32854) yordamida miqdori aniqlandi.
MTS tahlili hujayra proliferatsiyasini o'lchash uchun ishlatilgan.Hujayralar 2000 hujayra / quduqning boshlang'ich zichligida 96 quduqli plitalarga ekilgan.Hujayralarning nisbiy soni har kuni ko'rsatilgan vaqtda jami 4-6 kun davomida o'lchandi.Har bir quduq uchun 20 mkl MTS reaktivi (Promega) 100 mkl DMEM bilan suyultirildi, hujayralar bilan 4 soat davomida 37 ° C da inkubatsiya qilindi va keyin OD490 o'lchandi.
Ankorsiz o'sish qobiliyati sharlarning shakllanishini tahlil qilish orqali aniqlandi.Qisqacha aytganda, shRNA DARS-AS1 yoki nazorat shRNK bilan transfektsion qilingan 2000 ta hujayralar har 4 kunda oʻrtacha oʻzgarib turadigan ultra past biriktiruvchi mikroplastinkalarda (Korning) yetishtirildi.Sferoidlar 14 kundan keyin hisoblangan.DARS-AS1 haddan tashqari ekspression plazmidi yoki nazorat plazmidi bilan transfektsiyalangan 500 ta hujayradan kuchaytirish tahlili uchun foydalanilgan, aks holda usul o'zgarmagan.
RNK T7 RNK polimeraza va biotin-16-UTP (Roche 1138908910) yordamida Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440) ko'rsatmalariga muvofiq transkripsiya qilindi.Bu erda ishlatiladigan primerlar qo'shimcha 4-jadvalda keltirilgan.
Protein kodlovchi PACT yoki PKR hududlari pET15b (Addgene # 73619) ga klonlandi va BL21 (DE3) ga aylantirildi.Bakteriyalar ampitsillin bilan ta'minlangan LBda bir kechada inkubatsiya qilindi va keyin yangi LB bilan 100 marta suyultirildi.Muhitning OD600 qiymati 0,8 ga etganida, oqsil ifodasini qo'zg'atish uchun 1 mM IPTG qo'shildi.Bir kechada yumshoq chayqatish (20 ° C da 250 rpm) bilan inkubatsiyadan so'ng, hujayra pelleti santrifüjlash orqali yig'ildi (4000 rpm, 10 min, 4 ° C).Hujayra pelletini lizis buferida (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) qayta suspenziya qiling va muzda 30 daqiqa davomida inkubatsiya qiling, so'ngra sonikatsiya qiling (15 daqiqa, 5 s yoqish / o'chirish, muzda) va santrifüj (13,00000) rpm)., 30 min, 4°S).Keyin supernatant Ni-NTA qatroniga (QIAGEN) 3 marta 4 ° C da yuklandi, 4 marta yuvish tamponi (50 mM Tris, pH 8.0, 40 mM imidazol, 250 mM NaCl) bilan yuvildi va jami 3 marta elutildi. 10 ml eluent buferining (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 300 mM imidazol).Tozalangan oqsil WB yordamida aniqlandi va kontsentratsiya Qubit ™ protein tahlili to'plami (Thermo Fisher Scientific; Q 33212) yordamida aniqlandi.
RIP tahlillari avval tavsiflanganidek, o'zgartirishlar bilan amalga oshirildi.Qisqacha aytganda, 1x RIP buferi (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5% NP-40, RNasin ribonukleaza inhibitori (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, proteaza) xtostatic 71k lizis (Roche, 1 mM DTT) va 4 ° C da 15 daqiqa davomida 13000 rpm tezlikda santrifüj qiling.Keyin supernatant 5 mkg anti-PACT antikori (Abeam) yoki IgG (CST) bilan konjugatsiyalangan protein A+G magnit boncuklari (Millipore) bilan inkubatsiya qilindi.Boncuklar 5 marta 5x RIP buferi bilan yuvilgan, so'ngra proteinaz K (NEB) bilan hazm qilingan.RNK Trizol bilan ekstraksiya qilindi va RT-qPCR bilan aniqlandi.Primerlar qo'shimcha 5-jadvalda keltirilgan.
In vitro RIP tahlili o'zgartirilgan standart RIP tahlil protokoliga muvofiq amalga oshirildi.Jami 5 pmol in vitro transkripsiyalangan RNK RIP buferi bilan 1 marta suyultirildi va 65 ° C da 5 daqiqa davomida inkubatsiya qilinib, keyin xona haroratiga qadar sekin sovutildi.Jami 5 pmol buzilmagan yoki mutatsiyaga uchragan bayroq bilan belgilangan PACT oqsillari E. coli dan tozalandi.Renaturatsiyalangan RNK bilan 2 soat davomida 4°C da inkubatsiya qiling va bayroqqa qarshi IP uchun RIP tahlili uchun yuqoridagi tartibni bajaring.
RNK kengaytmasini tahlil qilish uchun 1x107 hujayra 1xRIP buferi bilan lizing qilindi.4 ° C da 15 daqiqa davomida 13000 rpm da santrifüjdan so'ng, supernatant 4 ° C da 2 soat davomida 30 mkl streptavidin magnit boncuklari (Bekman) bilan oldindan ishlov berildi.Keyin tozalangan lizat xamirturush tRNK bilan ta'minlandi va 4 ° C da bir kechada 40 pmol renaturlangan RNK bilan inkubatsiya qilindi, keyin yana 2 soat va BSA bilan bloklangan 20 mkl yangi streptavidin magnit boncuklari qo'shildi.Yuvish bosqichi 5x RIP buferi bilan 4 marta va 1x RIP buferi bilan 4 martadan iborat edi.Tegishli oqsillar biotinli elyusiya buferi (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 12,5 mM D-biotin, PMSF) bilan elutildi va NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen) da ajratildi.Kumush bo'yalgandan so'ng (Beyotime Biotechnology) ma'lum bantlar MS tomonidan kesilib, tahlil qilindi.
PACT va PKR o'rtasidagi o'zaro ta'sirni tekshirish uchun Co-IP tahlili o'tkazildi.Qisqacha aytganda, supernatant lizatlar 1 x RIP buferida 1 x 107 lizislangan hujayrani inkubatsiya qilish va 4 ° C da 15 daqiqa davomida 13000 rpm da santrifüjlash orqali tayyorlangan.Lizatlar protein A + G magnit boncuklari bilan to'ldirilgan, 5 mkg anti-PACT antikori bilan konjugatsiya qilingan va kechasi 4 ° C da muloyimlik bilan aylantirilgan.Boncuklar 3 marta 5 × RIP tampon bilan, ikki marta 1 × RIP tampon bilan yuvildi va 1 × SDS buferi bilan elutsiya qilindi.Qayta tiklangan oqsil SDS-PAGE jeli bilan tahlil qilindi va WB tomonidan aniqlandi.
Ikki pmol bayroqli PACT va 1 pmol PKR E. coli dan tozalandi.1× RIP buferida suyultiriladi va 4 °C da 2 soat davomida 10 pmol renaturlangan RNK bilan inkubatsiya qilinadi.Shundan so'ng, ular qo'shimcha ikki soat davomida protein A + G magnit boncuk bilan konjugatsiyalangan anti-yorliqli antikor bilan inkubatsiya qilindi.Keyin boncuklar 1x RIP buferi bilan to'rt marta yuvildi va 1x SDS buferi bilan elut qilindi.Olingan PACT va PKR JB tomonidan aniqlandi.