Yangiliklar

Nature.com saytiga tashrif buyurganingiz uchun tashakkur.Siz foydalanayotgan brauzer versiyasi cheklangan CSS-ni qo'llab-quvvatlaydi.Eng yaxshi tajriba uchun yangilangan brauzerdan foydalanishni tavsiya qilamiz (yoki Internet Explorer-da Moslik rejimini o'chirib qo'ying).Shu bilan birga, doimiy qo'llab-quvvatlashni ta'minlash uchun biz saytni uslublarsiz va JavaScript-ni ishlatmasdan taqdim etamiz.
Tirik hujayralardagi hujayra osti proteomalari va oqsil interaktorlarini xaritalash uchun faollashtirilgan efirlar yoki fenoksi radikallariga asoslangan fermentativ yaqinlikni belgilash usullari keng qo'llaniladi.Shu bilan birga, faollashtirilgan efirlar kamroq reaktivdir, buning natijasida keng yorliqlash radiusi paydo bo'ladi va peroksid bilan ishlov berish natijasida hosil bo'lgan fenoksi radikallari redoks yo'llariga xalaqit berishi mumkin.Bu erda biz miniSOG fotosensibilizator oqsilini qiziqtiradigan oqsil bilan genetik bog'lash orqali ishlab chiqilgan yaqinlik belgisiga bog'liq fotoaktivatsiya (PDPL) usuli haqida xabar beramiz.Ko'k yorug'lik bilan ishga tushiriladi va ta'sir qilish vaqti bilan boshqariladi, singlet kislorod hosil bo'ladi va keyin anilin probi tomonidan gistid qoldiqlarini fazoviy vaqt bilan hal qilingan etiketkaga erishiladi.Biz organellalarga xos proteom xaritalash orqali uning yuqori aniqligini namoyish etamiz.PDPLni TurboID bilan yonma-yon taqqoslash PDPLning yanada aniq va keng qamrovli proteomik qamrovini ko'rsatadi.Keyinchalik, biz PDPLni kasallik bilan bog'liq transkripsiya koaktivatori BRD4 va E3 Parkin ligazasiga qo'lladik va ilgari noma'lum interaktorlarni topdik.Haddan tashqari ekspressiya skriningi natijasida Parkin uchun ikkita noma'lum substrat, Ssu72 va SNW1 aniqlandi, ularning degradatsiyasi ubiquitinatsiya-proteazoma yo'li orqali amalga oshiriladi.
Protein tarmoqlarining aniq tavsifi ko'plab asosiy hujayra jarayonlari asosida yotadi.Shu sababli, oqsillarning o'zaro ta'sirining yuqori aniqlikdagi fazoviy-vaqt xaritasi biologik yo'llarni, kasallik patologiyasini ochish va terapevtik maqsadlarda bu o'zaro ta'sirlarni buzish uchun molekulyar asos bo'ladi.Shu maqsadda tirik hujayralar yoki to'qimalarda vaqtinchalik o'zaro ta'sirlarni aniqlashga qodir usullar juda ma'qul.Affinity Purification Mass Spectrometery (AP-MS) tarixan qiziqish uyg'otadigan oqsillarning (POI) bog'lovchi sheriklarini aniqlash uchun ishlatilgan.Miqdoriy proteomika usullarini ishlab chiqish bilan Bioplex3.0 AP-MS asosidagi oqsil tarmoqlarining eng yirik ma'lumotlar bazasi yaratildi.AP-MS juda kuchli bo'lsa-da, ish jarayonida hujayra lizisi va suyultirish bosqichlari zaif va o'tkinchi bog'lanish o'zaro ta'siriga yo'naltirilgan va lizizdan oldin bo'linmalarga ega bo'lmagan soxta o'zaro ta'sir juftliklari kabi lizizdan keyingi artefaktlarni kiritadi.
Ushbu muammolarni hal qilish uchun o'zaro bog'lanish guruhlari va fermentativ yaqin yorliqlash (PL) platformalari (masalan, APEX va BioID)5 bo'lgan tabiiy bo'lmagan aminokislotalar (UAA) ishlab chiqilgan.UAA usuli ko'plab stsenariylarda muvaffaqiyatli qo'llanilgan va to'g'ridan-to'g'ri protein yopishtiruvchi moddalar haqida ma'lumot bergan bo'lsa-da, UAA kiritish joyini optimallashtirish hali ham talab qilinadi.Eng muhimi, bu yorliqlash hodisalarining katalitik teskarisiga ega bo'lmagan stoxiometrik etiketlash usuli.Aksincha, bioID usuli kabi fermentativ PL usullari ishlab chiqilgan biotin ligazasini POI7 ga birlashtiradi, bu esa keyinchalik reaktiv biotinil-AMP ester oraliq mahsulotini hosil qilish uchun biotinni faollashtiradi.Shunday qilib, ferment faollashtirilgan biotinni katalizlaydi va proksimal lizin qoldiqlarini belgilaydigan "bulut" ni chiqaradi.Biroq, BioID 12 soatdan ko'proq vaqtni talab qiladi, bu esa uni vaqtinchalik ruxsat bilan ishlatishga to'sqinlik qiladi.Xamirturush displeyiga asoslangan yo'naltirilgan evolyutsiyadan foydalangan holda, TurboID yanada samaraliroq bo'lishi uchun BioID asosida ishlab chiqilgan bo'lib, 10 daqiqa ichida biotin bilan samarali yorliqlash imkonini beradi va yanada dinamik jarayonlarni o'rganish imkonini beradi.TurboID yuqori faolligi va endogen biotin darajalari past darajadagi yorliqlash uchun etarli bo'lganligi sababli, ekzogen biotin qo'shilishi bilan yuqori darajada takomillashtirilgan va vaqt belgilanishi kerak bo'lganda fon yorlig'i potentsial muammoga aylanadi.Bundan tashqari, faollashtirilgan efirlar yomon reaktivdir (t1/2 ~ 5 min), bu ayniqsa qo'shni oqsillarni biotin 5 bilan to'yingandan so'ng katta yorliqli radiusga olib kelishi mumkin. Boshqa yondashuvda, muhandislik askorbat peroksidazasining genetik sintezi (ya'ni biotin- fenol radikallari va oqsillarni bir daqiqa ichida etiketlash imkonini beradi9,10.APEX subcellular proteomlar, membrana oqsil komplekslari va sitozolik signalizatsiya oqsil komplekslarini aniqlash uchun keng qo'llaniladi11,12. Biroq, peroksidlarning yuqori konsentratsiyasiga bo'lgan ehtiyoj redoks oqsillari yoki yo'llariga ta'sir qilishi mumkin. hujayra jarayonlari.
Shunday qilib, hujayra yo'llarini sezilarli darajada buzmasdan, yuqori fazoviy va vaqtinchalik aniqlik bilan ko'proq reaktiv etiketli radiusli bostirish turlarini yaratishga qodir yangi usul mavjud usullarga muhim qo'shimcha bo'ladi. Reaktiv turlardan singlet kislorod o'zining qisqa umr ko'rish muddati va cheklangan diffuziya radiusi (hujayralarda t1/2 < 0,6 mks)13 tufayli e'tiborimizni tortdi. Reaktiv turlardan singlet kislorod o'zining qisqa umr ko'rish muddati va cheklangan diffuziya radiusi (hujayralarda t1/2 < 0,6 mks)13 tufayli e'tiborimizni tortdi. Sredi aktivnyx form nashe vnimanie privlek singletnyy kislorod iz-za ego korotkogo vremeni jizni va ogranichennogo radiusa diffuzii (t1/2 < 0,6 mks v hujayrax)13. Faol shakllar ichida singl kislorod o'zining qisqa umr ko'rish muddati va cheklangan diffuziya radiusi (hujayralarda t1/2 < 0,6 mks)13 tufayli e'tiborimizni tortdi.língíííííííííííííííííííííííííííííííííííííííníngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngínglínglíngíngíngíngíngíníngíngíníngínínínínínínínínínčnīngīngīngīngīngīngīngīngīngīīngīngīīīī 1/2 < 0.6 mknėngėng. 1/2 < 0,6 mks） mīngīngīngīngīngīngīnī13 Sredi aktivnyx forma nashe vnimanie privlekaet singletnyy kislorod iz-za ego korotkogo vremeni jizni va ogranichennogo radiusa diffuzii (t1/2 < 0,6 mks v hujayrax). Faol shakllar orasida yagona kislorod o'zining qisqa umr ko'rish muddati va cheklangan diffuziya radiusi (hujayralarda t1/2 < 0,6 mks) tufayli e'tiborimizni tortadi.Yagona kislorod metionin, tirozin, gistidin va triptofanni tasodifiy oksidlab, uni amin yoki tiol asosidagi zondlarga biriktirish uchun qutbli 14,15 ga aylantirgani xabar qilingan16,17.Singlet kislorodi hujayra osti bo'linmasi RNKni belgilash uchun ishlatilgan bo'lsa-da, endogen POI yaqinlik belgilarini qayta ishlatish strategiyalari o'rganilmagan.Bu erda biz fotoaktivatsiyaga bog'liq yaqinlik yorlig'i (PDPL) deb nomlangan platformani taqdim etamiz, bu erda biz miniSOG fotosensibilizatori bilan birlashtirilgan POIlarni yoritish uchun ko'k chiroqdan foydalanamiz va proksimal qoldiqlarni oksidlash uchun yagona kislorod hosil bo'lishini, so'ngra kimyoviy zondlarni oksidlash uchun amin o'z ichiga olgan modifikatsiyalarni qo'llaymiz. oraliq tirik hujayralar..Teg o'ziga xosligini maksimal darajada oshirish uchun kimyoviy problar guruhini sinovdan o'tkazdik va ochiq proteomik ish oqimidan foydalangan holda o'zgartirish joylarini aniqladik.PDPLni TurboID bilan yonma-yon taqqoslash PDPLning yanada aniq va keng qamrovli proteomik qamrovini ko'rsatadi.Biz ushbu yondashuvni subhujayra proteomasining organellalarga xos belgilariga va saraton bilan bog'liq epigenetik tartibga soluvchi protein BRD4 va Parkinson kasalligi bilan bog'liq E3 ligaza Parkin uchun bog'lovchi sheriklarning umumiy proteoma identifikatsiyasiga qo'lladik, bu proteinning ma'lum va noma'lum tarmog'ini tasdiqladi. o'zaro ta'sirlar..PDPL ning katta protein komplekslarida E3 substratlarini tanib olish qobiliyati bilvosita bog'lovchilarni tan olish zarur bo'lgan vaziyatni ifodalaydi.Ubiquitination-proteasome vositachiligida ikkita noma'lum parkin substratlari in situ tasdiqlangan.
Fotodinamik terapiya (PDT)19 va xromofor yordamida lazer inaktivatsiyasi (CALI)20, bunda fotosensibilizatorlar bilan yorug'lik nurlanishi yagona kislorod hosil qiladi, maqsadli oqsillarni faolsizlantirishi yoki hujayra o'limiga olib kelishi mumkin.Singletli kislorod nazariy diffuziya masofasi taxminan 70 nm bo'lgan yuqori reaktiv modda bo'lganligi sababli, fotosensibilizator atrofida fazoviy cheklangan oksidlanishni nazorat qilish mumkin.Ushbu kontseptsiyaga asoslanib, biz tirik hujayralardagi oqsil komplekslarining yaqin yorlig'iga erishish uchun yagona kisloroddan foydalanishga qaror qildik.Biz to'rt funktsiyani bajarish uchun PDPL kimyoproteomik yondashuvini ishlab chiqdik: (1) PL fermentativ yondashuviga o'xshash faol yagona kislorod hosil bo'lishini katalizlash;(2) yorug'lik boshlanishida vaqt bo'yicha yorliqlashni ta'minlash;(3) o'zgartirish orqali (4) Orqa fonni kamaytirish uchun endogen kofaktorlardan (masalan, biotin) foydalanishdan saqlaning yoki hujayraning atrof-muhit ta'siriga ta'sirini minimallashtirish uchun juda bezovta qiluvchi ekzogen reagentlardan (masalan, peroksidlar) foydalaning.
Fotosensibilizatorlarni ikkita toifaga bo'lish mumkin, jumladan kichik molekulyar og'irlikdagi ftoroforlar (masalan, atirgul bengal, metilen ko'k)22 va genetik jihatdan kodlangan kichik oqsillar (masalan, miniSOG, KillerRed)23.Modulli dizaynga erishish uchun biz POI24,25 ga fotosensibilizator (PS) oqsillarini qo'shish orqali birinchi avlod PDPL platformasini ishlab chiqdik (1a-rasm).Moviy yorug'lik bilan nurlantirilganda, yagona kislorod proksimal nukleofil aminokislotalar qoldiqlarini oksidlaydi, natijada elektrofil bo'lgan umpolung polaritesi paydo bo'ladi va keyinchalik amin prob nukleofillari bilan reaksiyaga kirishishi mumkin16,17.Prob LC/MS/MS xarakteristikasi uchun bosish kimyosi va pastga tushirish imkonini beruvchi alkin tutqichi bilan ishlab chiqilgan.
MiniSOG vositachiligida protein komplekslarini yorliqlashning sxematik tasviri.Moviy yorug'lik ta'sirida miniSOG-POI ifodalovchi hujayralar o'zaro ta'sir qiluvchi oqsillarni o'zgartiradigan, lekin bog'lanmaydigan oqsillarni o'zgartiradigan yagona kislorod hosil qiladi.Fotooksidlanishning oraliq mahsulotlari kovalent qo'shimchalarni hosil qilish uchun amin kimyoviy zondning rele belgilari bilan tutiladi.Kimyoviy zonddagi alkinil guruhi chertish kimyosini boyitish uchun pastga tushirish orqali, keyin LC-MS/MS miqdorini aniqlash imkonini beradi.b Omin problarining kimyoviy tuzilishi 1-4.c 1-4 problari yordamida mitoxondriyal lokalizatsiya qilingan miniSOG vositachiligidagi proteomik markerlarning vakili floresan gel tahlili va gel densitometriyasiga asoslangan nisbiy miqdorni aniqlash.Kimyoviy zondlarning signal-fon nisbati ko'k yorug'likdan tashqari salbiy nazorat tajribalari yoki miniSOG ifodasisiz HEK293T hujayralari yordamida baholandi.n = 2 ta biologik mustaqil namunalar.Har bir nuqta biologik nusxani ifodalaydi.d Ko'rsatilgan PDPL komponentlari mavjud yoki yo'qligida optimallashtirilgan prob 3 yordamida PDPLning vakili aniqlash va miqdorini aniqlash, masalan c.n = 3 ta biologik mustaqil namunalar.Har bir nuqta biologik nusxani ifodalaydi.O'rta chiziqlar va mo'ylovlar o'rtacha va ± standart og'ishlarni ifodalaydi.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Uzoq-qizil Si-DMA dog'i bilan yagona kislorodning konfokal tasviri.O'lchov paneli: 10 mikron.Jel tasvirlash va konfokal tajribalar o'xshash natijalar bilan mustaqil ravishda kamida ikki marta takrorlandi.
Biz birinchi navbatda HEK293T da barqaror ifodalangan miniSOG26 va KillerRed23 etuk fotosensibilizatorlarining kimyoviy zond sifatida proteomani propargilamin yorliqlanishiga vositachilik qilish qobiliyatini sinab ko'rdik (Qo'shimcha rasm 1a).Jel floresansi tahlili shuni ko'rsatdiki, miniSOG va ko'k yorug'lik nurlanishi yordamida butun proteom belgilariga erishildi, KillerRed bilan esa ko'rinadigan yorliqlash mahsuloti kuzatilmadi.Signal-fon nisbatini yaxshilash uchun biz anilin (1 va 3), propilamin (2) yoki benzilamin (4) o'z ichiga olgan kimyoviy problar to'plamini sinab ko'rdik.Biz HEK293T hujayralarining o'zlari ko'k nur yo'qligi bilan solishtirganda yuqori fon signaliga ega ekanligini kuzatdik, ehtimol endogen riboflavin fotosensibilizatori, flavin mononukleotid (FMN) 27 tufayli. Anilin asosidagi kimyoviy zondlar 1 va 3 yaxshi o'ziga xoslikni berdi, HEK293T mitoxondriyadagi miniSOG ni barqaror ifodalaydi, bu 3-zond uchun signalning >8 baravar oshishini ko'rsatadi, 2-zond esa RNK-yorliqlash usulida CAP-seq faqat ~2,5-ni ko'rsatadi. RNK va oqsil o'rtasidagi turli xil reaktivlik imtiyozlariga bog'liq bo'lgan signalning ortishi (1b, c-rasm). Anilin asosidagi kimyoviy zondlar 1 va 3 yaxshi o'ziga xoslikni berdi, HEK293T mitoxondriyadagi miniSOG ni barqaror ifodalaydi, bu 3-zond uchun signalning >8 baravar oshishini ko'rsatadi, 2-zond esa RNK-yorliqlash usulida CAP-seq faqat ~2,5-ni ko'rsatadi. RNK va oqsil o'rtasidagi turli xil reaktivlik imtiyozlariga bog'liq bo'lgan signalning ortishi (1b, c-rasm).Anilin asosidagi kimyoviy zondlar 1 va 3 yaxshi o'ziga xoslikni ko'rsatdi: mitoxondriyadagi miniSOG ni barqaror ifodalovchi HEK293T 3-zond uchun signalning 8 baravar ko'proq o'sishini ko'rsatadi, prob 2 esa CAP-seq RNK yorliqlash usulida qo'llaniladi, faqat RNK va oqsil o'rtasidagi turli xil reaktivlik imtiyozlari tufayli, ehtimol, signalning ~ 2,5 barobar oshishini ko'rsatadi (1b, c-rasm).基于苯胺的化学探针1 和3 具有更好的特异性，HEK293T 在线粒体中稳定表达miniSOG，探针3 的信号增加> 8 倍，而用于RNA 标记方法CAP-seq 的探针2 仅显示~ 2.5-chàngíííííí, ííííííííííníRNK ííííííííííííníngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíníngíngíngínė1b，c）① ② ③ ④ 1 和 3 ~, HEK293T 表达 表达 表达 表达 表达 表达 表达 表达 表达 表达 表达 表达 表达 表达 表达 表达 探针 探针 探针 探针 探针 探针 探针 探针 探针 探针 探针 探针 探针 探针 探针 探针 探针 探针 探针 探针 探针 探针 探针 探针 探针 探针 探针 探针 探针 探针 探针 探针 探针 探针 探针 ↑. -dínzíníní, díngínínínínRNKAnilin asosidagi kimyoviy problar 1 va 3 yaxshi o'ziga xoslikka ega edi, HEK293T mitoxondriyadagi miniSOGni barqaror ifoda etdi va 3-zond signalni 8 baravar oshirdi, CAP-seq RNK yorliqlash usuli uchun 2-zond esa atigi 2,5 baravar ko'paygan.signalda, ehtimol, RNK va oqsil o'rtasidagi turli xil reaktsiya imtiyozlari tufayli (1b, s-rasm).Bundan tashqari, prob 3 izomerlari va gidrazin zondlari (5, 6, 7 zondlar) sinovdan o'tkazildi, bu esa 3-zondning optimallashtirilganligini tasdiqladi (Qo'shimcha rasm. 1b, c).Xuddi shunday, jel ichidagi floresan tahlili boshqa optimallashtirilgan eksperimental parametrlarni ham aniqladi: nurlanish to'lqin uzunligi (460 nm), kimyoviy zond kontsentratsiyasi (1 mM) va nurlanish vaqti (20 min) (Qo'shimcha rasm 2a-c).PDPL protokolidagi biron bir komponent yoki qadamni o'tkazib yuborish signalning fonga sezilarli darajada o'zgarishiga olib keldi (1d-rasm).Ta'kidlash joizki, natriy azid yoki troloks ishtirokida oqsil yorlig'i sezilarli darajada kamaydi, ular yagona kislorodni so'ndiradi.Singlet kislorodni barqarorlashtirish uchun ma'lum bo'lgan D2O mavjudligi etiketka signalini kuchaytiradi.Boshqa reaktiv kislorod turlarining etiketkaga qo'shgan hissasini o'rganish uchun mannitol va S vitamini gidroksil va superoksid radikallarini o'rnatish uchun mos ravishda 18, 29 qo'shildi, ammo ular etiketkalashni kamaytirish uchun topilmadi.H2O2 qo'shilishi, lekin yorug'lik emas, etiketkaga olib kelmadi (Qo'shimcha rasm 3a).Si-DMA problari bilan floresan yagona kislorodli tasvir HEK293T-miniSOG simida yagona kislorod mavjudligini tasdiqladi, lekin asl HEK293T simida emas.Bundan tashqari, mitoSOX Red yorug'likdan keyin superoksid hosil bo'lishini aniqlay olmadi (1e-rasm va qo'shimcha 3b-rasm) 30. Bu ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, singlet kislorod keyingi proteomik belgilar uchun javobgar bo'lgan asosiy reaktiv kislorod turidir.PDPL ning sitotoksikligi baholandi, shu jumladan ko'k nurli nurlanish va kimyoviy zondlar va sezilarli sitotoksiklik kuzatilmadi (Qo'shimcha 4a-rasm).
Yorliqlash mexanizmini o'rganish va LC-MS / MS yordamida protein komplekslarini proteomik identifikatsiya qilish uchun biz birinchi navbatda qaysi aminokislotalar o'zgartirilganligini va prob belgilarining delta massasini aniqlashimiz kerak.Metionin, histidin, triptofan va tirozinning yagona kislorod bilan o'zgartirilishi haqida xabar berilgan14,15.Biz TOP-ABPP31 ish jarayonini MSFragger32 asosidagi FragPipe hisoblash platformasi tomonidan taqdim etilgan xolis ochiq qidiruv bilan birlashtiramiz.Singlet kislorod modifikatsiyasi va kimyoviy zond etiketkasidan so'ng, bo'linadigan bog'lovchini o'z ichiga olgan biotinni kamaytirish yorlig'i yordamida chertish kimyosi amalga oshirildi, so'ngra neytravidin cho'zilishi va tripsin hazm bo'ldi.Hali ham qatron bilan bog'langan o'zgartirilgan peptid LC-MS / MS tahlili uchun fotosellangan (2a-rasm va qo'shimcha ma'lumotlar 1).50 dan ortiq peptid xaritasi (PSM) o'yinlari ro'yxatga olingan (2b-rasm) bilan proteomda ko'plab modifikatsiyalar sodir bo'ldi.Ajablanarlisi shundaki, biz faqat histidinning modifikatsiyasini kuzatdik, ehtimol oksidlangan histidinning boshqa aminokislotalarga qaraganda anilin problariga nisbatan yuqori reaktivligi tufayli.Gistidinning yagona kislorod bilan oksidlanishining nashr etilgan mexanizmiga ko'ra, +229 Da ning taklif qilingan delta-massa tuzilishi ikki oksidlanishdan keyin 3-zondning 2-okso-histidin bilan qo'shilishiga mos keladi, +247 Da esa gidroliz mahsulotidir. ning +229 Da (qo'shimcha 5-rasm).MS2 spektrini baholash y va b ionlarining ko'pchiligini aniqlashning yuqori ishonchliligini ko'rsatdi, shu jumladan modifikatsiyalangan fragment ionlarini (y va b) identifikatsiyalash (2c-rasm).PDPL bilan o'zgartirilgan gistidinlarning mahalliy ketma-ketligini kontekst tahlili ±1 pozitsiyalarda kichik hidrofobik qoldiqlar uchun mo''tadil motif afzalligini aniqladi (Qo'shimcha rasm 4b).Har bir oqsil uchun o'rtacha 1,4 gistidin aniqlandi va bu belgilarning joylari erituvchiga kirish mumkin bo'lgan sirt maydoni (SASA) va nisbiy erituvchi mavjudligi (RSA) tahlillari bilan aniqlandi (Qo'shimcha rasm. 4c, d).
MSFragger tomonidan quvvatlanadigan FragPipe hisoblash platformasidan foydalangan holda qoldiq selektivlikni o'rganish uchun xolis ish jarayoni.Streptavidin qatronidan modifikatsiyalangan peptidlarning foto bo'linishiga ruxsat berish uchun ajraladigan bog'lovchilar Click kimyosida qo'llaniladi.Ko'plab o'zgartirishlar, shuningdek, tegishli qoldiqlarni aniqlash uchun ochiq qidiruv boshlandi.b Proteomada sodir bo'ladigan modifikatsiyalar massasini belgilang.Peptid xaritalash PSM.c 3-zond bilan o'zgartirilgan histidin joylarining MS2 spektral izohi. Vakolatli misol sifatida, 3-zond bilan kovalent reaksiya o'zgartirilgan aminokislotaga +229,0938 Da qo'shdi.d PDPL belgilarini sinash uchun ishlatiladigan mutatsiya tahlili.PRDX3 (H155A, H225A) va PRDX1 (H10A, H81A, H169A) Bayroqqa qarshi aniqlash uchun yovvoyi tipdagi plazmidlar bilan transfektsiya qilindi.e Sintetik peptid 3-zond ishtirokida tozalangan miniSOG bilan reaksiyaga kirdi va LC-MS spektrida Dm +247 va +229 bilan mos keladigan mahsulotlar qayd etildi.f miniSOG-6xHis-tag va anti-6xHis antikorlari bilan modellashtirilgan in vitro oqsil-oqsil o'zaro ta'siri.Antibiotin (streptavidin-HRP) va sichqonchaga qarshi Western blot tahlili, yorug'lik ta'sir qilish vaqtiga qarab, 3-zond bilan belgilangan miniSOG-6xHis/anti-6xHis antikor komplekslari.Alohida oqsillar uchun teglar mos keladigan molekulyar og'irlikda ifodalanadi: LC antikorining engil zanjiri, HC antikorining og'ir zanjiri.Ushbu tajribalar mustaqil ravishda kamida ikki marta o'xshash natijalar bilan takrorlandi.
Yorliqlash joyini biokimyoviy tekshirish uchun massa spektrometriyasi bilan aniqlangan PRDX3 va PRDX1 histidindan alaninga o'zgartirildi va transfeksiya tahlillarida yovvoyi tur bilan solishtirildi.PDPL natijalari shuni ko'rsatdiki, mutatsiya yorliqlashni sezilarli darajada kamaytirdi (2d-rasm).Shu bilan birga, ochiq qidiruvda aniqlangan peptid ketma-ketliklari sintez qilindi va in vitroda 3-zond va ko'k yorug'lik ishtirokida tozalangan miniSOG bilan reaksiyaga kirdi, LC-MS tomonidan aniqlanganda massa siljishi +247 va +229 Da bo'lgan mahsulotlarni berdi (1-rasm). 2e).).MiniSOG fotoaktivatsiyasiga javoban o'zaro ta'sir qiluvchi proksimal oqsillarni in vitroda belgilash mumkinmi yoki yo'qligini tekshirish uchun biz miniSOG-6xHis oqsili va in vitro anti-O'zining monoklonal antikori o'rtasidagi o'zaro ta'sir orqali sun'iy yaqinlik tahlilini ishlab chiqdik (2f-rasm).Ushbu tahlilda biz miniSOG bilan antikor og'ir va engil zanjirlarning proksimal belgilarini kutdik.Aslida, sichqonchaga qarshi (anti-6xHis-belgilangan antikorning og'ir va engil zanjirlarini tanib olish) va streptavidin G'arbiy blotlar og'ir va engil zanjirlarning kuchli biotinilatsiyasini ko'rsatdi.Ta'kidlash joizki, biz 6xHis yorlig'i va engil va og'ir zanjirlar o'rtasidagi o'zaro bog'liqlik tufayli miniSOG avtobiotinilatsiyasini payqadik, bu lizin va 2-okso-histidin proksimal reaktsiyasi o'rtasidagi ilgari tasvirlangan bo'shliq bilan bog'liq bo'lishi mumkin.Xulosa qilib aytganda, PDPL histidinni yaqinlikka bog'liq holda o'zgartiradi degan xulosaga keldik.
Bizning keyingi maqsadimiz in situ yorlig'ining o'ziga xosligini sinab ko'rish uchun hujayra osti proteomasini tavsiflash edi.Shuning uchun biz HEK293T hujayralarining yadrosida, mitoxondriyal matritsasida yoki tashqi ER membranasida miniSOG ni barqaror ravishda ifodaladik (3a-rasm).Jel lyuminestsent tahlili uchta subcellular joylarda ko'p yorliqli chiziqlarni, shuningdek, turli etiketleme naqshlarini aniqladi (3b-rasm).Floresan tasvirni tahlil qilish PDPLning yuqori o'ziga xosligini ko'rsatdi (3c-rasm).PDPL ish jarayonidan keyin floresan mikroskopiya yordamida subhujayrali proteomalarni aniqlash uchun rodamin bo'yoqlari bilan bosish reaktsiyalari amalga oshirildi va PDPL signallari DAPI, mitoxondrial kuzatuvchilar yoki ER kuzatuvchilari bilan birgalikda lokalizatsiya qilindi, bu PDPLning yuqori aniqligini tasdiqladi.Uchta organella joylashuvi uchun PDPL ni TurboID bilan avidin western blot yordamida yonma-yon taqqoslash PDPL ularning tegishli boshqaruvlari bilan solishtirganda aniqroq etiketlanganligini ko'rsatdi.PDPL sharoitida ko'proq etiketli chiziqlar paydo bo'ldi, bu ko'proq PDPL etiketli oqsillarni ko'rsatadi (Qo'shimcha rasm 6a-d).
miniSOG vositachiligidagi organellalarga xos proteoma belgilarining sxematik ko'rinishi.miniSOG inson COX4 ning N-terminal 23 aminokislotalariga (mito-miniSOG), yadroga H2B (yadro-miniSOG) va ER membranasining sitoplazmatik tomoni (ER-miniSOG) orqali Sec61b bilan sintez orqali mitoxondriyal matritsani nishonga oladi. ).Ko'rsatkichlar jel tasvirini, konfokal tasvirni va massa spektrometrini o'z ichiga oladi.b uchta organellaga xos PDPL profilining vakillik jel tasvirlari.CBB Coomassie Brilliant Blue.v V5 (qizil) etiketli antikor tomonidan aniqlangan turli subhujayra lokalizatsiyalari bilan miniSOG ni barqaror ifodalovchi HEK293T hujayralarining vakillik konfokal tasvirlari.Hujayra osti markerlari mitoxondriya va ER (yashil) uchun ishlatiladi.PDPL ish jarayoni Cy3-azid-klik kimyosi yordamida miniSOG (sariq) etiketli hujayra osti proteomalarini aniqlashni o'z ichiga oladi.O'lchov paneli: 10 mikron.d Turli organellalardagi PDPL yorlig'i bilan belgilangan proteomalarning vulkanik uchastkalari yorliqsiz miqdoriy aniqlash (n = 3 ta mustaqil biologik tajriba).Ikki dumli Student t-testi vulqon uchastkalarida ishlatilgan.HEK293T yovvoyi turi salbiy nazorat sifatida ishlatilgan. Sezilarli darajada o'zgargan oqsillar qizil rang bilan ta'kidlangan (p <0,05 va >2 marta ion intensivligi farqi). Sezilarli darajada o'zgargan oqsillar qizil rang bilan ta'kidlangan (p <0,05 va >2 marta ion intensivligi farqi). Znachitelno izmenennye belki vydeleny krasnym tsvetom (p < 0,05 va >2-kratnaya raznitsa v intensivnosti ionov). Sezilarli darajada o'zgargan oqsillar qizil rang bilan ta'kidlangan (p <0,05 va ion intensivligidagi >2 barobar farq).língííííííííííííííííííííníínííníínííníínínínjínjínílí (p < 0.05 dí> 2 dííííííílíngíííííííííínííníínííníínínínínínjínjínjínjínjínjínjínínjínjínjínjínjín (p < 0.05lí> 2 Znachitelno izmenennye belki vydeleny krasnym tsvetom (p < 0,05 i > 2-kratnaya raznitsa v ionnoy sile). Sezilarli darajada o'zgargan oqsillar qizil rang bilan ta'kidlangan (p <0,05 va > ion kuchida 2 barobar farq).HEK293T-miniSOG uchun muhim, lekin HEK293T uchun muhim bo'lmagan tegishli oqsillar yashil rangda ko'rsatilgan.e Tajribalardan olingan proteomik ma'lumotlar to'plamining o'ziga xosligini tahlil qilish d.Har bir organelladagi statistik ahamiyatga ega oqsillarning umumiy soni (qizil va yashil nuqta) tepada belgilanadi.Gistogrammalar MitoCarta 3.0, GO tahlili va A. Ting va boshqalar asosida organellalarda lokalizatsiya qilingan oqsillarni ko'rsatadi.odamlar.Mitoxondriyalar, yadrolar va ER uchun alohida ma'lumotlar to'plami.Ushbu tajribalar mustaqil ravishda kamida ikki marta o'xshash natijalar bilan takrorlandi.Xom ma'lumotlar xom ma'lumotlar fayllari shaklida taqdim etiladi.
Jel va tasvirlash natijalaridan rag'batlantirilgan holda, har bir organellada aniqlangan proteoma miqdorini aniqlash uchun yorliqsiz miqdor qo'llanildi (Qo'shimcha ma'lumotlar 2).O'tkazilmagan HEK293T fon belgilarini olib tashlash uchun salbiy nazorat sifatida ishlatilgan. Vulkan uchastkasi tahlili sezilarli darajada boyitilgan oqsillarni (p<0,05 va >2 marta ion intensivligi) hamda faqat miniSOG ifodalovchi chiziqlarda mavjud bo'lgan yagona oqsillarni ko'rsatdi (3d qizil va yashil nuqtalar). Vulkan uchastkasi tahlili sezilarli darajada boyitilgan oqsillarni (p<0,05 va >2 marta ion intensivligi) hamda faqat miniSOG ifodalovchi chiziqlarda mavjud bo'lgan yagona oqsillarni ko'rsatdi (3d qizil va yashil nuqtalar). Analiz grafik vulkana pokazal znachitelno obogashchennye belki (p <0, 05 i > 2-kratnaya intensiv ionov), va shunga o'xshash odinochnye belki, kotorye prisutstvuyut tolko v liniyax, ekspressiruyushchix miniSOG, rissnye znachiched. Vulkan uchastkasining tahlili sezilarli darajada boyitilgan oqsillarni (p<0,05 va >2 marta ion intensivligi) hamda faqat miniSOG ifodalovchi chiziqlarda mavjud bo'lgan yagona oqsillarni ko'rsatdi (3d-rasm, qizil va yashil nuqta).① ② ③ ↑① ② ③ ④ (p <0.05 ↑ 在于 存 在于 在于 在于 系 系 ↑))))))))) Analiz grafik vulkana vyyavil znachitelno obogashchennye belki (p <0, 05 i> 2x ionnaya sil), a shunga o'xshash otdelnye belki, prisutstvuyushchie tolko v ekspressionnoy linii miniSOG (krasnye va zelenye tochki na ris. 3d). Vulkan uchastkasining tahlili sezilarli darajada boyitilgan oqsillarni (p<0,05 va >2x ion kuchi) va faqat miniSOG ifoda chizig'ida mavjud bo'lgan yagona oqsillarni (3d-rasmdagi qizil va yashil nuqtalar) aniqladi.Ushbu ma'lumotlarni birlashtirib, biz mos ravishda 1364, 461 va 911 statistik ahamiyatga ega yadro, mitoxondrial va ER tashqi membrana oqsillarini aniqladik.Organel-lokalizatsiyalangan PDPLning aniqligini tahlil qilish uchun biz MitoCarta 3.0, Gen Ontology (GO) tahlilini va A. Ting va boshqalarni ishlatdik.73,4, 78,5 va 73,0% aniqlikka mos keladigan aniqlangan oqsillarning organella o'ziga xosligini tekshirish uchun mitoxondriya, yadro va ER uchun ma'lumotlar to'plami8 ishlatilgan (3e-rasm).PDPLning o'ziga xosligi PDPLning organellalarga xos proteomalarni aniqlash uchun ideal vosita ekanligini tasdiqlaydi.Shunisi e'tiborga loyiqki, aniqlangan mitoxondriyal oqsillarning submitoxondrial tahlili shuni ko'rsatdiki, tutilgan proteoma asosan matritsa va ichki membranada (mos ravishda 226 va 106) taqsimlangan bo'lib, aniqlangan mitoxondriyal oqsillarning umumiy sonining 91,7% (362) ni tashkil qiladi.PDPLning yuqori darajasi qo'shimcha ravishda tasdiqlandi (Qo'shimcha rasm 7a).Xuddi shunday, subyadroviy tahlil ushlangan proteoma asosan yadro, nukleoplazma va yadrochada tarqalganligini ko'rsatdi (Qo'shimcha 7b-rasm).Yadro lokalizatsiyasi signali peptidi (3xNLS) bilan yadro proteomik tahlili H2B konstruktsiyasiga o'xshash aniqlikni ko'rsatdi (Qo'shimcha rasm. 7c-h).PDPL markerining o'ziga xosligini aniqlash uchun yadroviy laminin A ko'proq diskret lokalizatsiya qilingan POI7 tuzog'i sifatida tanlangan.PDPL 36 ta sezilarli darajada boyitilgan oqsillarni aniqladi, ulardan 12 tasi (30,0%, shu jumladan, lamin A) yaxshi tavsiflangan lamin A oqsillari bo'lib, String ma'lumotlar bazasida izohlanadi, BioID usulidan (122 ta oqsil) 28 ning 28 tasi. , 22,9 %) 7. Bizning usulimiz kamroq oqsillarni aniqladi, ehtimol cheklangan yorliqlash joylari tufayli, bu faolroq yagona kislorod tufayli mumkin bo'ldi.GO tahlili aniqlangan oqsillar asosan nukleoplazma (26), yadro membranasi (10), yadro membranasi (9) va yadro teshiklarida (5) joylashganligini ko'rsatdi.Birgalikda, bu yadroviy lokalizatsiya qilingan oqsillar boyitilgan oqsillarning 80% ni tashkil etib, PDPLning o'ziga xosligini yanada ko'rsatadi (Qo'shimcha rasm 8a-d).
PDPLning organellalarda yaqinlik belgilarini amalga oshirish qobiliyatini o'rnatganimizdan so'ng, biz PDPL POI bog'lovchi sheriklarini tahlil qilish uchun ishlatilishi mumkinligini sinab ko'rdik.Xususan, biz sitozolik oqsillarning PDPL tahlilini aniqlashga harakat qildik, ular o'zlarining yuqori dinamik tabiati tufayli membrana-lokallashtirilgan hamkasblariga qaraganda qiyinroq maqsadlar hisoblanadi.Bromodomain va ekstraterminal (BET) oqsili BRD4 turli kasalliklarda asosiy roli uchun bizning e'tiborimizni tortdi 35, 36.BRD4 tomonidan hosil qilingan kompleks transkripsiyaviy koaktivator va muhim terapevtik maqsaddir.C-myc va Wnt5a transkripsiya omillarining ifodasini tartibga solish orqali BRD4 o'tkir miyeloid leykemiya (AML), ko'p miyelom, Burkitt limfomasi, yo'g'on ichak saratoni va yallig'lanish kasalliklarining asosiy determinanti hisoblanadi37,38.Bundan tashqari, ba'zi viruslar papillomavirus, OIV va SARS-CoV-236,39 kabi virus va hujayra transkripsiyasini tartibga solish uchun BRD4 ni maqsad qilib qo'yadi.
PDPL yordamida BRD4 shovqinini xaritalash uchun biz miniSOG ni BRD4 ning qisqa N- yoki C-terminal izoformasi bilan birlashtirdik.Proteomik natijalar ikkita konstruktsiya o'rtasida yuqori darajadagi o'xshashlikni aniqladi (Qo'shimcha rasm 9a).MiniSOG-H2B bilan aniqlangan yadro proteomasi BRD4 bilan o'zaro ta'sir qiluvchi oqsillarning 77,6% ni qoplaydi (Qo'shimcha rasm 9b).Keyin marker radiusini sozlash uchun turli xil yoritish vaqtlari (2, 5, 10, 20 min) ishlatilgan (4a-rasm va qo'shimcha ma'lumotlar 3).Xulosa qilamizki, qisqaroq fotoperiodlarda PDPL birinchi navbatda to'g'ridan-to'g'ri bog'lovchi sheriklarni belgilaydi, uzoqroq vaqtlar esa qisqaroq fotoaktivatsiya davrlarida aniqlangan oqsillarni, shuningdek etiketkalash komplekslarida bilvosita maqsadlarni o'z ichiga oladi.Darhaqiqat, biz qo'shni vaqt nuqtalari o'rtasida kuchli o'xshashlikni topdik (2 va 5 daqiqa uchun 84,6%; 5 va 10 daqiqa uchun 87,7%; 10 va 20 daqiqa uchun 98,7%) (4b-rasm va qo'shimcha 9c-rasm).Barcha eksperimental guruhlarda biz nafaqat BRD4 o'z-o'zini yorlig'ini, balki qator ma'lumotlar bazasida izohlangan MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A va HMGB1 kabi bir nechta ma'lum maqsadlarni topdik.Ushbu nishonlarning ion kuchi ta'sir qilish vaqtiga mutanosibdir (4c-rasm va qo'shimcha 9d-rasm).2 daqiqali guruhda aniqlangan oqsillarning GO tahlili aniqlangan oqsillar yadroda lokalizatsiya qilinganligini va kromatinni qayta qurish va RNK polimeraza funktsiyasida ishtirok etganligini ko'rsatdi.Proteinning molekulyar funktsiyasi BRD4 funktsiyasiga mos keladigan kromatin bilan bog'lanish yoki transkripsiyaviy koaktivatsiya bilan boyitilgan (4d-rasm).String ma'lumotlar bazasi bilan faollashtirilgan oqsil o'zaro ta'siri tahlili BRD4 va HDAC bilan bog'laydigan atsetillangan gistonlarga mos keladigan SIN3A, NCOR2, BCOR va SAP130 (4e-rasm va qo'shimcha rasm. 9e) kabi BRD4 va HDAC oilasining o'zaro ta'sir qiluvchi komplekslari o'rtasidagi bilvosita o'zaro ta'sirlarning birinchi darajasini aniqladi. ..Bundan tashqari, LC-MS / MS tomonidan aniqlangan vakillik maqsadlari, jumladan Sin3A, NSUN2, Fus va SFPQ, Western blotting tomonidan tasdiqlangan (4f-rasm).So'nggi paytlarda BRD4 ning qisqa izoformasi suyuqlik-suyuqlik fazasini ajratish (LLPS) xususiyatlariga ega bo'lgan yadrolarni hosil qilishi haqida xabar berilgan.RNKni bog'lovchi oqsillar Fus va SFPQ turli xil hujayra jarayonlarining LLPS larida vositachilik qiladi va bu erda qayd etilmagan BRD4 bog'lovchi oqsillar sifatida aniqlangan.BRD4 va SFPQ o'rtasidagi o'zaro ta'sir koimmunoprecipitatsiya (ko-IP) tajribalari bilan tasdiqlangan (4g-rasm), bu BRD4 vositachiligida suyuqlik-suyuqlik fazalarini ajratish uchun qo'shimcha tekshirishga loyiq boshqa mexanizmni taklif qiladi.Birgalikda olingan bu natijalar shuni ko'rsatadiki, PDPL ma'lum BRD4 o'zaro ta'sir qiluvchi va noma'lum bog'lovchi oqsillarni aniqlash uchun ideal platformadir.
miniSOG vositachiligidagi BRD4 yaqinlik belgilarining sxematik ko'rinishi, ta'sir qilish vaqtlari: 2, 5, 10 va 20 min.b turli xil yoritish vaqtlarida aniqlangan oqsillarning bir-birining ustiga chiqishi.HEK293T-miniSOG-BRD4 da aniqlangan oqsilni boyitish yovvoyi HEK293T bilan solishtirganda statistik ahamiyatga ega edi.c Belgilanmagan ta'sir qilish vaqti davomida ma'lum bo'lgan BRD4-bog'lovchi oqsillarni miqdoriy aniqlashda ion intensivligi.n = 3 ta biologik mustaqil namunalar.Ma'lumotlar o'rtacha ± standart og'ish sifatida taqdim etiladi.d 2 daqiqali guruhda aniqlangan oqsillarning gen ontologik tahlili (GO).Birinchi o'nta GO atamasi sanab o'tilgan.Pufakchalar GO atamasi toifasiga ko'ra ranglanadi va qabariq hajmi har bir atamada topilgan oqsillar soniga mutanosibdir.e BRD4 bilan o'zaro ta'sir qiluvchi oqsillarning string tahlili.Sariq doiralar to'g'ridan-to'g'ri elim, kulrang doiralar esa bilvosita elimning birinchi qatlamidir.Qizil chiziqlar eksperimental ravishda aniqlangan o'zaro ta'sirlarni, ko'k chiziqlar esa bashorat qilingan shovqinlarni ifodalaydi.f LC-MS/MS da aniqlangan vakil BRD4 ulanish maqsadlari Western blotting tomonidan tekshirildi.g Co-immunopresipitatsiya tajribalari SFPQ va BRD4 o'rtasidagi o'zaro ta'sirni tasdiqlaydi.Ushbu tajribalar mustaqil ravishda kamida ikki marta o'xshash natijalar bilan takrorlandi.Xom ma'lumotlar xom ma'lumotlar fayllari shaklida taqdim etiladi.
Ro'yxatga olinmagan POI bilan bog'liq maqsadlarni aniqlashdan tashqari, biz PDPL fermentlar uchun substratlarni aniqlash uchun mos bo'ladi, deb taxmin qilamiz, bu esa ro'yxatdan o'tmagan substratlarga izoh berish uchun katta komplekslardagi bilvosita bog'lovchi oqsillarni tavsiflashni talab qiladi.Parkin (PARK2 tomonidan kodlangan) E3 ligazadir va parkindagi mutatsiyalar avtosomal retsessiv balog'atga etmagan Parkinson kasalligini (AR-JP) keltirib chiqarishi ma'lum42.Bundan tashqari, parkin mitofagiya (mitoxondriyal otofagiya) va reaktiv kislorod turlarini olib tashlash uchun zarur deb ta'riflangan.Biroq, bir nechta parkin substratlari aniqlangan bo'lsa-da, bu kasallikda parkinning roli noaniqligicha qolmoqda.Belgilanmagan substratlarga izoh berish uchun PDPL parkinning N yoki C-terminusiga miniSOG qo'shish orqali sinovdan o'tkazildi.PINK1-Parkin yo'li orqali parkinni faollashtirish uchun hujayralar karbonil siyanid proton tashuvchisi m-xlorofenilgidrazon (CCCP) bilan ishlov berildi.Bizning BRD4 PDPL natijalari bilan solishtirganda, parkin N-terminus termoyadroviy ko'proq maqsadli oqsillar to'plamini aniqladi, garchi u C-terminusning katta qismini qamrab olgan bo'lsa ham (210 tadan 177 tasi) (5a, b va qo'shimcha ma'lumotlar 4).natija N-terminal teglari Parkin44 ni anormal tarzda faollashtirishi mumkinligi haqidagi xabarlarga mos keladi.Ajablanarlisi shundaki, bizning ma'lumotlarimizda Parkin43 uchun nashr etilgan AP-MS natijalari bilan atigi 18 ta bir-biriga o'xshash oqsillar mavjud edi, bu hujayra liniyalari va proteomik ish oqimlari o'rtasidagi farq tufayli.Ikki usul bilan aniqlangan to'rtta ma'lum protein (ARDM1, HSPA8, PSMD14 va PSMC3) bilan bir qatorda (5c-rasm)43.LC-MS/MS natijalarini yanada tasdiqlash uchun HEK293T ota-hujayra tahlili natijalarini va barqaror N-terminal parkin chizig'ini solishtirish uchun PDPL davolash va undan keyingi Western blotlash qo'llanildi.Ilgari noma'lum bo'lgan CDK2, DUT, CTBP1 va PSMC4 maqsadlari ma'lum bo'lgan DNAJB1 bilan sinovdan o'tkazildi (5d-rasm).
HEK293T hujayralarida parkin bilan o'zaro ta'sir qiluvchi oqsillarning vulqon syujeti parkinning N yoki C-terminusiga birlashtirilgan barqaror ifodalangan miniSOG bilan (n = 3 ta mustaqil biologik tajriba).Ikki dumli Student t-testi vulqon uchastkalarida ishlatilgan.HEK293T salbiy nazorat sifatida ishlatilgan. Sezilarli darajada o'zgargan oqsillar qizil rang bilan ta'kidlangan (p <0,05 va >2 marta ion intensivligi farqi). Sezilarli darajada o'zgargan oqsillar qizil rang bilan ta'kidlangan (p <0,05 va >2 marta ion intensivligi farqi). Znachitelno izmenennye belki vydeleny krasnym tsvetom (p < 0,05 va >2-kratnaya raznitsa v intensivnosti ionov). Sezilarli darajada o'zgargan oqsillar qizil rang bilan ta'kidlangan (p <0,05 va ion intensivligidagi >2 barobar farq).língííííííííííííííííííííníínííníínííníínínínjínjínílí (p < 0.05 dí> 2 dííííííílíngíííííííííínííníínííníínínínínínjínjínjínjínjínjínjínínjínjínjínjínjín (p < 0.05lí> 2 Znachitelno izmenennye belki vydeleny krasnym tsvetom (p < 0,05 i > 2-kratnaya raznitsa v ionnoy sile). Sezilarli darajada o'zgargan oqsillar qizil rang bilan ta'kidlangan (p <0,05 va > ion kuchida 2 barobar farq).HEK293T-miniSOG uchun muhim, lekin HEK293T uchun muhim bo'lmagan tegishli oqsillar yashil rangda ko'rsatilgan.b Venn diagrammasi N-terminal va C-terminal konstruktsiyalari o'rtasida bir-biriga yopishgan oqsillarni ko'rsatadi.N-terminal teglari parkinni anormal tarzda faollashtirishi va ko'proq taniqli oqsillarni keltirib chiqarishi mumkin.c Venn diagrammasi PDPL va AP-MS o'rtasidagi bir-biriga mos keladigan oqsillarni ko'rsatadi.Ma'lum bo'lgan interaktorlar ro'yxatga olingan, jumladan, PDPLda aniqlangan 18 ta bir-biriga o'xshash 4 ta oqsil va 159 ta oqsildan 11 tasi.d LC-MS/MS tomonidan aniqlangan vakillik maqsadlari Western blotting tomonidan tasdiqlangan.e Ssu72 va SNW1 ro'yxatdan o'tmagan parkin substratlari sifatida aniqlandi.Ushbu FLAG-belgilangan protein plazmidlari HEK293T va HEK293T-Parkin-miniSOG ga transfektsiya qilindi, so'ngra turli vaqt nuqtalarida CCCP bilan ishlov berildi.Buzilish Parkinning haddan tashqari ifodalash chizig'ida ko'proq namoyon bo'ldi.f MG132 proteazoma inhibitori yordamida Ssu72 va SNW1 ning parchalanish jarayoni proteazoma-ubiquitinatsiya orqali sodir bo'lishi tasdiqlandi.Ushbu tajribalar mustaqil ravishda kamida ikki marta o'xshash natijalar bilan takrorlandi.Xom ma'lumotlar xom ma'lumotlar fayllari shaklida taqdim etiladi.
Ta'kidlash joizki, PDPL tomonidan aniqlangan oqsillar parkinni bog'laydigan oqsillarni va ularning substratlarini o'z ichiga olishi kerak.Ro'yxatdan o'tmagan parkin substratlarini aniqlash uchun biz ettita aniqlangan oqsilni (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 va SNW1) va transfektsiyalangan plazmidlarni tanladik, bu genlarni normal HEK293T ga ta'sir qilish va miniSOG-Parkin ning HEK29CCCP bilan davolashni barqaror ifodalash.Ssu72 va SNW1 oqsillarining darajalari barqaror miniSOG-Parkin liniyasida sezilarli darajada kamaydi (5e-rasm).12 soat davomida CCCP bilan davolash ikkala substratning eng muhim degradatsiyasiga olib keldi.Ssu72 va SNW1 ning degradatsiyasi proteazoma-ubiquitinatsiya bilan tartibga solinishi yoki yo'qligini tekshirish uchun proteazoma inhibitori MG132 proteazoma faolligini inhibe qilish uchun qo'shildi va aslida biz ularning parchalanish jarayoni inhibe qilinganligini aniqladik (5f-rasm).Substrat bo'lmagan qo'shimcha maqsadlar G'arbiy blot yordamida Parkin interaktorlari sifatida tasdiqlandi (Qo'shimcha rasm. 10), bu LC-MS/MS bilan izchil natijalarni ko'rsatdi.Xulosa qilib aytadigan bo'lsak, PDPL ish oqimining maqsadli protein transfeksiyasini tekshirish bilan integratsiyalashuvi ro'yxatdan o'tmagan E3 ligaza substratlarini aniqlash imkonini beradi.
Biz umumiy yaqinlikni belgilash platformasini ishlab chiqdik, bu sizga fazoda va vaqtda o'zaro ta'sir qiluvchi POIlarni aniqlash imkonini beradi.Platforma miniSOG fotosensibilizator oqsiliga asoslanadi, u atigi 12 kDa, etuk APEX2 fermentining yarmidan kam (27 kDa) va TurboID ning uchdan bir qismi (35 kDa).Kichikroq o'lcham kichik protein interaktomlarini o'rganish uchun ilovalar doirasini sezilarli darajada kengaytirishi kerak.Singletli kislorodning kvant rentabelligini oshirish va bu yondashuvning sezgirligini kengaytirish uchun genetik kodlangan oqsillar yoki kichik molekulalar bo'ladimi, qo'shimcha fotosensibilizatorlarni yanada tadqiq qilish kerak.MiniSOG ning joriy versiyasi uchun yaqinlik belgilarini faollashtirish uchun ko'k yoritish yordamida yuqori vaqtinchalik ruxsatga erishish mumkin.Bundan tashqari, uzoqroq ta'sir qilish vaqti singlet kislorodning kattaroq "bulutini" chiqardi, bu esa ko'proq distal gistidin qoldiqlarini o'zgartirishga, etiketlash radiusini oshirishga va PDPL fazoviy o'lchamlarini nozik sozlash qobiliyatiga olib keldi.Shuningdek, biz signal-fon nisbatini oshirish uchun ettita kimyoviy zondni sinab ko'rdik va bu yondashuv ortidagi molekulyar mexanizmni o'rganib chiqdik.TOP-ABPP ish jarayoni xolis ochiq qidiruv bilan birgalikda modifikatsiyalar faqat histidinlarda sodir bo'lganligini tasdiqladi va gistidin modifikatsiyalarining ko'payishi uchun izchil mikro muhit kuzatilmadi, halqa mintaqasida histidinlar uchun o'rtacha afzallik bundan mustasno.
PDPL shuningdek, proteoma o'ziga xosligi va qamrovi bilan, hech bo'lmaganda boshqa yaqinlik belgilari va organellalarga xos kimyoviy zond usullari bilan solishtirish mumkin bo'lgan subhujayrali proteomalarni tavsiflash uchun ham ishlatilgan.Yaqinlik belgilari ham sirt, lizosomal va sekretoma bilan bog'liq proteomalarni tavsiflash uchun muvaffaqiyatli ishlatilgan46,47.Biz PDPL bu subhujayra organellalari bilan mos kelishiga ishonamiz.Bundan tashqari, biz PDPLni dinamik xususiyatlari va ko'proq vaqtinchalik o'zaro ta'sirlarda ishtirok etishi tufayli membrana bilan bog'langan oqsillarga qaraganda murakkabroq bo'lgan sitozolik oqsillarni bog'lash maqsadlarini aniqlab oldik.PDPL ikkita oqsilga, transkripsion koaktivator BRD4 va kasallik bilan bog'liq ligaza E3 Parkinga qo'llanildi.Bu ikki oqsil nafaqat asosiy biologik funktsiyalari, balki klinik ahamiyati va terapevtik salohiyati uchun ham tanlangan.Ushbu ikkita POI uchun taniqli majburiy sheriklar va ro'yxatdan o'tmagan maqsadlar aniqlandi.Ta'kidlash joizki, fazalarni ajratish bilan bog'liq protein SFPQ ko-IP tomonidan tasdiqlangan, bu BRD4 (qisqa izoform) LLPSni tartibga soluvchi yangi mexanizmni ko'rsatishi mumkin.Shu bilan birga, biz Parkin substratlarini identifikatsiya qilish bilvosita yopishtiruvchi moddalarni identifikatsiyalash talab qilinadigan stsenariy ekanligiga ishonamiz.Biz ikkita noma'lum parkin substratini aniqladik va ularning ubiquitination-proteasome yo'li bo'ylab degradatsiyasini tasdiqladik.Yaqinda gidrolaza substratlarini fermentlar bilan tutib aniqlash uchun mexanizmga asoslangan tutib olish strategiyasi ishlab chiqildi.Bu juda kuchli usul bo'lsa-da, u katta komplekslar hosil bo'lishida ishtirok etuvchi substratlarni tahlil qilish uchun mos emas va ferment va substrat o'rtasida kovalent bog'lanish hosil bo'lishini talab qiladi.Biz PDPLni deubikitinaz va metalloproteaz oilalari kabi boshqa protein komplekslari va ferment oilalarini o'rganish uchun kengaytirilishi mumkinligini kutamiz.
SOPP3 deb nomlangan miniSOG ning yangi shakli yagona kislorod ishlab chiqarish yaxshilangan holda ishlab chiqilgan.Biz miniSOG-ni SOPP3 bilan taqqosladik va yaxshilangan markalash samaradorligini topdik, garchi signal-shovqin nisbati o'zgarishsiz qoldi (Qo'shimcha 11-rasm).Biz SOPP3 ni optimallashtirish (masalan, yo'naltirilgan evolyutsiya orqali) qisqa yorug'lik vaqtini talab qiladigan samaraliroq fotosensibilizator oqsillariga olib keladi va shu bilan ko'proq dinamik hujayra jarayonlarini ushlashga imkon beradi, deb faraz qildik.Shunisi e'tiborga loyiqki, PDPLning joriy versiyasi uyali muhit bilan cheklangan, chunki u ko'k yorug'lik yoritilishini talab qiladi va chuqur to'qimalarga kira olmaydi.Bu xususiyat hayvonlar modelini o'rganishda foydalanishni istisno qiladi.Biroq, optogenetikaning PDPL bilan kombinatsiyasi hayvonlarni, ayniqsa miyada tadqiqot qilish imkoniyatini berishi mumkin.Bundan tashqari, boshqa muhandislik infraqizil fotosensibilizatorlar ham bu cheklovni olib tashlaydi.Hozirda bu borada izlanishlar olib borilmoqda.
HEK293T hujayra liniyasi ATCC (CRL-3216) dan olingan.Hujayra chizig'i mikoplazma infektsiyasi uchun salbiy sinovdan o'tkazildi va 10% homila sigir zardobi (FBS, Vistech, #SE100-B) va 1% penitsillin/streptomitsin (Hyclone, #SV3001) bilan to'ldirilgan DMEM (Thermo, #C11995500BT)da yetishtirildi.da oʻsgan.
3-aminofenilen (3-namuna) va (4-etinilfenil)metanamin (4-namuna) Bidepharm kompaniyasidan sotib olindi.Propilamin (zond 2) Energy-chemicals kompaniyasidan sotib olindi.N-(2-Aminofenil)pent-4-namid (prob 1) nashr etilgan usullarga muvofiq sintez qilindi.
Qo'shimcha 1-jadvalda ushbu tadqiqotda foydalanilgan genetik konstruktsiyalar keltirilgan.MiniSOG va KillerRed ketma-ketliklari P. Zou (Peking universiteti) sovg'a plazmididan klonlangan.Mitoxondriyal matritsani nishonga olish ketma-ketligi COX4 ning 23 N-terminal aminokislotalaridan olingan va Gibson majmuasi (Beyotime, # D7010S) yordamida ko'rsatilgan vektorlarga klonlangan.Endoplazmatik retikulumning membranasi va yadrosini nishonga olish uchun HEK293T hujayralarining cDNK kutubxonasidan PCR orqali kuchaytirilgan SEC61B inson DNKsi (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) va H2B DNK (D. Lin, Shenzhen koʻrfazi laboratoriyasi tomonidan taqdim etilgan) va yuqorida aytib o'tilganidek, klonlangan.Agar boshqacha ko'rsatilmagan bo'lsa, transfeksiya va barqaror hujayra liniyalarini qurish uchun ishlatiladigan boshqa protein genlari HEK293T hujayra cDNK kutubxonasidan PCR kuchaytirildi.G3S (GGGS) va G4S (GGGGS) o'lja oqsili va miniSOG o'rtasida bog'lovchi sifatida ishlatilgan.Ushbu termoyadroviy konstruktsiyalarga V5 epitop yorlig'i (GKPIPNPLLGLDST) qo'shildi.Sutemizuvchilarda ifodalash va barqaror hujayra liniyasini o'rnatish uchun miniSOG termoyadroviy konstruktsiyasi pLX304 lentiviral vektoriga subklonlangan.Bakterial ekspressiya uchun miniSOG C terminalida 6xHis etiketli pET21a vektoriga klonlandi.
HEK293T xujayralari har bir quduqqa 2,0 x 105 hujayradan oltitali plitalarga ekilgan va 24 soatdan so'ng rekombinant lentiviral plazmidlar (2,4 mkg pLX304) va virusli qadoqlash plazmidlari (1,5 mkg psPAX2 va 1,2 mkg MD02.G02 vaqt bilan) bilan transfekte qilingan. , #C0533), taxminan 80% termoyadroviy.Bir kechada transfeksiyadan so'ng, vosita o'zgartirildi va yana 24 soat davomida inkubatsiya qilindi.Virusni yig'ish 24, 48 va 72 soatdan keyin amalga oshirildi.Maqsadli hujayra liniyalari infektsiyasidan oldin virusli muhit 0,8 mkm filtr (Merck, #millex-GP) orqali filtrlangan va 8 mkg / ml konsentratsiyaga polibrene (Solarbio, # H8761) qo'shilgan.24 soatdan keyin hujayralar muhitni o'zgartirish orqali tiklanishiga ruxsat berildi.Hujayralar 5 mkg/ml blastitsidin (Solarbio, # 3513-03-9) yordamida dastlabki uchta o'tish uchun pastroq qattiq tanlov sifatida tanlangan.Keyin keyingi uchta o'tish uchun yanada qattiqroq rejim sifatida 20 mkg / ml dan foydalaniladi.
Hujayralar 12 quduqli kameralarga (Ibidi, # 81201) har bir quduqqa taxminan 20 000 hujayra zichligida ekilgan.HEK293T hujayralarining yopishishini yaxshilash uchun 37°C da fosfat tamponlangan sho'r suvda (PBS, Sangon, #B640435) suyultirilgan 50 mkg/ml fibronektin (Corning, #356008) qo'shing.Kameralar 1 soat davomida oldindan ishlov berildi va keyin PBS bilan olib tashlandi.24 soatdan keyin hujayralar bir marta PBS bilan yuvildi, yangi Hanksning muvozanatli tuz eritmasida (HBSS, Gibco, # 14025092) 1 mM prob 3 bilan 37 ° C da 1 soat davomida inkubatsiya qilindi va keyin ko'k LED (460 nm) bilan inkubatsiya qilindi. ).) xona haroratida 10 daqiqa davomida nurlantirildi.Shundan so'ng, hujayralar ikki marta PBS bilan yuvildi va xona haroratida 15 daqiqa davomida PBS (Sangon, # E672002) da 4% formaldegid bilan mahkamlandi.Ruxsat etilgan hujayralardan ortiqcha formaldegid uch marta PBS bilan yuvib tashlangan.Keyin hujayralar PBSda 0,5% Triton X-100 (Sangon, # A600198) bilan o'tkazuvchanlikka ega bo'ldi va PBS bilan 3 marta yuvildi.Keyin kamerani olib tashlang va har bir namunaga 50 mkM Cy3-azid (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) o'z ichiga olgan 25 mkl klik reaktsiyasi aralashmasi qo'shing. va 0,5 mg/ml natriy askorbat (Aladdin, no. S105024) va xona haroratida 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilinadi.Tezkor reaktsiyadan so'ng hujayralar olti marta 0,05% Tween-20 (Sangon, # A600560) (PBST) o'z ichiga olgan PBS bilan yuvildi va keyin xona haroratida 30 daqiqa davomida PBSTda 5% BSA (Abcone, # B24726) bilan bloklandi.
Kolokalizatsiya immuno-bo'yash uchun hujayralar ko'rsatilgan shartlarga muvofiq birlamchi antikorlar bilan inkubatsiya qilindi: sichqoncha anti-V5 yorlig'i mAb (1:500, CST, #80076), quyon anti-Hsp60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), quyon poliklonal kalnexinga qarshi antikor (1:500, Abcam, #ab22595) yoki quyonga qarshi lamin A/C monoklonal antikor (1:500; CST, #2032) kechada 4 °C da.PBST bilan 3 marta yuvilgandan so'ng, hujayralar ikkilamchi antikorlar bilan inkubatsiya qilindi: echki quyonga qarshi Alexa Fluor 488 (Termo, # A11034) 1: 1000 nisbatda suyultirildi, echki sichqonchaga qarshi Alexa Fluor 594 (CST, # 8889) 1: 1: 000 suyultirilgan.suyultirish Xona haroratida 30 daqiqa davomida suyultiriladi.Keyin hujayralar PBST bilan 3 marta yuvildi va xona haroratida 10 daqiqa davomida PBSda DAPI (Thermo, # D1306) bilan bo'yaldi.PBS bilan 3 marta yuvishdan so'ng, hujayralar ko'rish uchun PBS da 50% glitserin (Sangon, # A600232) bilan muhrlangan.Immunofluoresan tasvirlar ZEISS LSM 900 Airyscan2 konfokal mikroskop va ZNE 3.5 dasturi yordamida olingan.
Singlet kislorodli lyuminestsent tasvirlash uchun hujayralar Hanks HEPES buferiga 100 nM Si-DMA qo'shilishidan oldin ikki marta Hanks HEPES buferi bilan yuvilgan (DOJINDO, # MT05).Nur ta'siridan so'ng hujayralar CO2 inkubatorida 37 ° C da 45 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi.Keyin hujayralar Hanksning HEPES buferi bilan ikki marta yuvildi va xona haroratida 10 daqiqa davomida Hanks HEPES buferida Hoechst bilan bo'yaldi va ZEISS LSM 900 konfokal mikroskop yordamida vizualizatsiya qilindi., #M36008) tarkibida kaltsiy va magniy bo'lgan HBSS buferida.Yorug'lik yoki doksorubitsin (MCE, #HY-15142A) ta'siridan so'ng hujayralar CO2 inkubatorida 37 ° C da 10 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi, HBSS buferi bilan ikki marta yuvildi va xona haroratida HBSS buferida Hoechst bilan inkubatsiya qilindi.daqiqa.Doksorubitsin ijobiy prob nazorati sifatida ishlatilgan, bunda hujayralar 30 daqiqa davomida 1% BSA o'z ichiga olgan HBSSda 20 mkM doksorubitsin bilan ishlov berilgan.Immunofluoresan tasvirlar Zeiss LSM 900 konfokal mikroskop yordamida olingan.
Mito-miniSOG ni barqaror ifodalovchi HEK293T hujayralari 15 sm idishlarga taxminan 30% zichlikda ekilgan.48 soatdan so'ng, ~80% qo'shilishga erishilganda, hujayralar bir marta PBS bilan yuvildi, yangi HBSS buferida 1 mM Probe 3 bilan 37 ° C da 1 soat davomida inkubatsiya qilindi va keyin xonada 10 daqiqa davomida ko'k LED bilan yoritilgan. harorat..Shundan so'ng, hujayralar ikki marta PBS bilan yuvildi, qirib tashlandi va EDTA-siz proteaz inhibitörlerini (MCE, # HY-K0011) o'z ichiga olgan muzli PBS buferida qayta suspenziya qilindi.Hujayralar uchini 1 daqiqa davomida (35% amplitudada 1 soniya yoqilgan va 1 soniya o'chirilgan) sonikatsiya qilish orqali lizing qilindi.Olingan aralash qoldiqlarni olib tashlash uchun 15,871 xg da 10 daqiqa davomida 4 ° C da santrifüj qilindi va supernatant konsentratsiyasi BCA protein tahlili to'plami (Beyotime, # P0009) yordamida 4 mg / ml ga o'rnatildi.Yuqoridagi 1 ml lizatni 0,1 mM fotodegradatsiyalanuvchi biotin azid (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, # A600974), 0,1 mM TBTA ligand (Aladdin, # T162437) va SO4 inkubator bilan birlashtiring. xona haroratida 1 soat davomida aylanish.Tez reaktsiyadan so'ng, aralashmani 10 ml shisha flakonga oldindan aralashtirilgan eritma (MeOH: CHCl3: H2O = 4 ml: 1 ml: 3 ml) qo'shing.Namunalar aralashtirildi va xona haroratida 10 daqiqa davomida 4500 g da santrifüj qilindi.Pastki va yuqori eritmalar tashlandi, cho'kma ikki marta 1 ml metanol bilan yuvildi va 15871 × g da 5 daqiqa davomida 4 ° C da santrifüj qilindi.Cho‘kmani eritish uchun 25 mM ammoniy bikarbonatga (ABC, Aladdin, № A110539) 1 ml 8 M karbamid (Aladdin, № U111902) qo‘shing.Namunalar 10 mM ditiotreitol (Sangon, 25 mM ABCda # A100281) bilan 55 ° C da 40 daqiqa davomida qayta tiklandi, keyin qorong'ida xona haroratida 15 mM yangi yodoasetamid (Sangon, # A600539) qo'shildi.30 daqiqa ichida alkillanish..Reaksiyani to'xtatish uchun qo'shimcha 5 mM ditiotreitol qo'shildi.Har bir namuna uchun taxminan 100 µl NeutrAvidin agaroza boncuklarini (Thermo, #29202) 3 marta 1 ml PBS bilan yuvib tayyorlang.Yuqoridagi proteom eritmasi 5 ml PBS bilan suyultirildi va xona haroratida 4 soat davomida oldindan yuvilgan NeutrAvidin agaroz boncuklari bilan inkubatsiya qilindi.Keyin boncuklar 0,2% SDS (Sangon, # A600485) o'z ichiga olgan 5 ml PBS bilan 3 marta, 1 M karbamid o'z ichiga olgan 5 ml PBS bilan 3 marta va 5 ml ddH2O bilan 3 marta yuvildi.Keyin boncuklar santrifüjlash orqali yig'ib olindi va 1 M karbamid, 1 mM CaCl 2 (Macklin, # C805228) va 20 ng / mkl tripsin (Promega, # V5280) o'z ichiga olgan 200 mkl 25 mM ABCda qayta suspenziya qilindi.Aylanish bilan 37 ° C da tun davomida tripsizing.Reaksiya pH 2-3 ga yetguncha chumoli kislotasi (Termo, # A117-50) qo'shib to'xtatildi.Boncuklar 0,2% SDS o'z ichiga olgan 1 ml PBS bilan 3 marta, 1 M karbamid o'z ichiga olgan 1 ml PBS bilan 3 marta, keyin esa 1 ml distillangan suv bilan 3 marta yuvildi.O'zgartirilgan peptidlar 200 mkl 70% MeOH yordamida 90 daqiqa davomida engil lizis (365 nm) orqali chiqarildi.Santrifüjdan so'ng supernatant yig'ildi.Keyin boncuklar bir marta 100 mkl 70% MeOH bilan yuvildi va supernatantlar birlashtirildi.Namunalar Speedvac vakuumli kontsentratorida quritilgan va tahlilga qadar -20 ° C da saqlanadi.
Singlet kislorodli modifikatsiyalangan peptidlarni aniqlash va miqdorini aniqlash uchun namunalar 0,1% chumoli kislotasida qayta eritildi va 1 mkg peptidlar Tune va 4.3 sotuvchi dasturiy ta'minotidan Xcalibur nano ESI manbasi bilan jihozlangan Orbitrap Fusion Lumos Tribrid massa spektrometri yordamida tahlil qilindi.Namunalar 3 mkm C18 moddasi (ReproSil-pur, #r13.b9.) bilan 75 mkm × 15 sm ichki qadoqlangan kapillyar ustunda ajratildi va EASY-nLC 1200 UHPLC tizimiga (Thermo) ulandi.Peptidlar chiziqli 95 daqiqali gradient xromatografiyasi bilan 8% erituvchi B dan 50% erituvchi B ga ajratildi (A = suvda 0,1% chumoli kislotasi, B = 80% asetonitrilda 0,1% chumoli kislotasi), so'ngra chiziqli ravishda 98% B min gacha oshirildi. 6 daqiqada 300 nl / min oqim tezligida.Orbitrap Fusion Lumos ma'lumotlarga qarab to'liq MS va MS2 skanerlash o'rtasida navbatma-navbat ma'lumotlarni to'playdi.Cho'kish kuchlanishi 2,1 kV ga o'rnatildi va ion tashish kapillyarining harorati 320 ° C ni tashkil etdi.MS spektrlari (350-2000 m / z) 120 000, AGC 4 × 105 va 150 ms maksimal kirish vaqti bilan to'plangan.Har bir to'liq skanerlashda 10 ta eng keng tarqalgan ko'paytiriladigan zaryadlangan prekursorlar HCD yordamida 30% normallashtirilgan to'qnashuv energiyasi, 1,6 m / z to'rt kutupli izolyatsiya oynasi va 30 000 piksellar soniga ega bo'lgan qismlarga bo'lingan.5×104 va maksimal kiritish vaqti 150 ms dan foydalangan holda tandem massa spektrometriyasi uchun AGC maqsadi.Dinamik istisno 30 soniyaga o'rnatiladi. Tayinlanmagan ionlar yoki zaryadi 1+ va >7+ bo'lganlar MS/MS uchun rad etildi. Tayinlanmagan ionlar yoki zaryadi 1+ va >7+ bo'lganlar MS/MS uchun rad etildi. MS/MS uchun Nenaznachennye ion ili ion s zaryadom 1+ va >7+ byli otklonny. MS/MS uchun tayinlanmagan ionlar yoki 1+ va >7+ zaryadli ionlar rad etildi.míngíngíngííníínííníínínínínín 1+ mí>7+ míngíngíngínmínmínmínmínmínmín MS/MS。míngíngíngííníínííníínínínínín 1+ mí>7+ míngíngíngínmínmínmínmínmínmín MS/MS。 MS/MS uchun Neukazannye ion ili ion s zaryadami 1+ va >7+ byli otklonny. MS/MS uchun aniqlanmagan ionlar yoki 1+ va >7+ zaryadli ionlar rad etildi.
Xom ma'lumotlar MSFragger asosidagi FragPipe hisoblash platformasi yordamida qayta ishlanadi.Ommaviy moyillik va mos keladigan aminokislotalar -150 dan 500 Da gacha bo'lgan prekursor massa bardoshliligi bilan ochiq qidiruv algoritmi yordamida aniqlandi.Keyin modifikatsiyalangan peptidlar PDda +229,0964 va +247,1069 Da (Proteome Discoverer 2.5, Thermo) massa ortishi bilan histidin modifikatsiyalari yordamida aniqlandi.
Birlashtirilgan miniSOG genini barqaror ifodalovchi hujayralar 6 sm hajmdagi idishlarga solingan.~80% qo'shilish darajasiga erishgandan so'ng, hujayralar bir marta HBSS (Gibco, # 14025092) bilan yuvildi, so'ngra HBSS da kimyoviy problar bilan 37 ° C da 1 soat davomida inkubatsiya qilindi va ko'k chiroq bilan yoritilgan.Xona haroratida 20 daqiqa davomida 10 Vt LED.PDPLda qaysi turdagi reaktiv kislorod turlari ishtirok etishini aniqlash uchun 0,5 mM vitamin C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0) , Qo'shimchalar sifatida hujayralarga 100 mM mannitol (Energy Chemical, # 69-65-8), 100 mkM H2O2, 10 mM NaN3 qo'shildi.Sovuq PBS bilan yuvilgandan so'ng, hujayralar qirib tashlandi, 1,5 ml santrifüj naychalariga to'plandi va EDTA'siz 1x proteaz inhibitori bilan 200 mkl PBSda 1 daqiqa davomida uchi bilan sonikatsiya qilindi (1 s va 1 s holda, amplituda 35%).Olingan aralash 15,871 × g da 10 daqiqa davomida 4 ° C da santrifüj qilindi va supernatant konsentratsiyasi BCA protein tahlili to'plami yordamida 1 mg / ml ga o'rnatildi.Yuqoridagi lizatning taxminan 50 µl 0,1 mM rodamin azid (Aladdin, № T131368), 1 mM TCEP, 0,1 mM TBTA ligand va 1 mM CuSO4 bilan 1 soat davomida xona haroratida pastdan yuqoriga aylantirilgan holda inkubatsiya qilindi.Bosish reaktsiyasidan so'ng, aseton bilan cho'ktirish namunalarga 250 mkl oldindan sovutilgan aseton qo'shib, -20 ° C da 20 daqiqa davomida inkubatsiya qilish va 4 ° C da 10 daqiqa davomida 6010 × g santrifüj qilish orqali amalga oshirildi.Peletni to'plang va 50 µl 1x Laemmli buferida 95 °C da 10 daqiqa qaynatib oling.Keyin namunalar SDS-PAGE uzun jellarida tahlil qilindi va Image Lab Touch dasturi bilan Bio-rad ChemiDoc MP Touch tasvirlash tizimi yordamida vizualizatsiya qilindi.
Rekombinant miniSOG-6xHis oqsilini ifodalash va tozalash yuqorida tavsiflanganidek amalga oshirildi.Qisqacha aytganda, E. coli BL21 (DE3) hujayralari (TransGen, # CD701-02) pET21a-miniSOG-6xHis bilan o'zgartirildi va protein ifodasi 0,5 mM IPTG (Sangon, # A600168) bilan indüklendi.Hujayra lizisidan so'ng oqsillar Ni-NTA agaroz boncuklari (MCE, № 70666) yordamida tozalandi, PBS ga qarshi dializ qilindi va -80 ° C da saqlanadi.
Antikor asosidagi in vitro yorliq yaqinlik tahlili uchun PBSda 100 mkM tozalangan miniSOG, 1 mM prob 3 va 1 mkg anti-yorliqli sichqoncha monoklonal antikorini (TransGen, #HT501-01) umumiy reaksiya hajmi 50 mkl gacha aralashtiring..Reaktsiya aralashmasi xona haroratida 0, 2, 5, 10 va 20 daqiqa davomida ko'k LED chiroq bilan nurlantirildi.Aralash 0,1 mM biotin-PEG3-azid (Aladdin, # B122225), 1 mM TCEP, 0,1 mM TBTA ligand va 1 mM CuSO4 bilan xona haroratida 1 soat davomida yuqoriga qarab harakatlanuvchi silkitgichda inkubatsiya qilindi.Tez reaktsiyadan so'ng, to'g'ridan-to'g'ri aralashmaga 4x Laemmli buferini qo'shing va 95 ° C da 10 daqiqa qaynatib oling.Namunalar SDS-PAGE jellarida tahlil qilindi va streptavidin-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068) bilan western blotting orqali tahlil qilindi.
C-terminal amidatsiyasi (LHDALDAK-CONH2) bilan histidin o'z ichiga olgan sintetik peptid yaqin atrofdagi peptidga asoslangan in vitro etiketlashni tahlil qilish uchun ishlatilgan.Ushbu tahlilda 100 mkM tozalangan miniSOG, 10 mM prob 3 va 2 mkg/ml sintetik peptid PBSda 50 mkl umumiy reaksiya hajmida aralashtirildi.Reaksiya aralashmasi xona haroratida 1 soat davomida ko'k LED yorug'lik bilan nurlantirildi.Bir mikrolitr namuna LC-MS tizimi (Waters, MassLynx spektrini tahlil qilish dasturi bilan SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight massa spektrometri) yordamida tahlil qilindi.
MiniSOG termoyadroviy genini barqaror ifodalovchi HEK293T hujayralari turli organellalar lokalizatsiyasi (Mito, ER, Nucleus) uchun 10 sm idishlarga va Parkin-miniSOG va BRD4-miniSOG liniyalari uchun 15 sm idishlarga ekilgan.~90% qo'shilish darajasiga erishgandan so'ng, hujayralar bir marta HBSS bilan yuvildi, so'ngra HBSS da 3-zond bilan 1 soat davomida 37 ° C da inkubatsiya qilindi va xona haroratida 10 Vt ko'k LED bilan yoritilgan.Parkinni kontaktsiz yorliqlash uchun 10 mkM proton karbonil siyanid tashuvchisi m-xlorofenilgidrazon CCCP (Solarbio, #C6700) HBSS da 3-zond bilan 37°C da 1 soat davomida qo‘shildi.Hujayra lizisi, bosish kimyosi, qaytarilish va alkillanish bosqichlari yuqorida tavsiflangani bilan bir xil edi, faqat 2 mg lizat qo'shildi va fotodegradatsiyalanuvchi biotin azid o'rniga bosish reaktsiyasida biotin PEG3 azid ishlatilgan.Boyitishdan so'ng, boncuklar 0,2% SDS o'z ichiga olgan 5 ml PBS bilan 3 marta, 1 M karbamid o'z ichiga olgan 5 ml PBS bilan 3 marta va 5 ml PBS bilan 3 marta yuvildi.Shundan so'ng oqsilni bir kechada 37°C da parchalash uchun tarkibida 1 M karbamid bo'lgan 300 mkl 25 mM ABC ga 2 mkg tripsin qo'shildi.Reaksiya pH 2-3 ga etgunga qadar chumoli kislotasini qo'shib to'xtatildi.Boncuklar ustida tripsinizatsiya qilingandan so'ng, peptid eritmasi SOLAµ HRP ustuni (Thermo, №60209-001) yordamida tuzsizlantirildi va Speedvac vakuumli kontsentratorida quritildi.Peptidlar 0,1% chumoli kislotasida qayta eritildi va 500 ng peptidlar yuqorida tavsiflangan nano-ESI manbasi bilan jihozlangan Orbitrap Fusion Lumos Tribrid massa spektrometri yordamida tahlil qilindi.Peptidlar tijorat RP-HPLC old ustunlarida (75 mkm x 2 sm) (Termo, № 164946) va analitik RP-HPLC ustunlarida (75 mkm x 25 sm) (Thermo, № 164941) ajratilgan, ikkalasi ham 2 mkm bilan to'ldirilgan.gradient 8% dan 35% gacha ACN 60 daqiqada, keyin chiziqli ravishda 300 Nl / min oqim tezligida 6 daqiqada 98% B gacha ko'tariladi.MS spektrlari (350-1500 m / z) 60 000, AGC 4 × 105 va 50 ms maksimal kirish vaqti bilan to'plangan.Tanlangan ionlar HCD tomonidan ketma-ket 3 sek tsiklda normallashtirilgan to'qnashuv energiyasi 30%, to'rt kutupli izolyatsiya oynasi 1,6 m/z va o'lchamlari 15000. 5 × 104 tandem massa spektrometri AGC nishoni va maksimal in'ektsiya vaqti bilan ketma-ket parchalandi. 22 ms ishlatilgan.Dinamik istisno 45 soniyaga o'rnatiladi. Tayinlanmagan ionlar yoki zaryadi 1+ va >7+ bo'lganlar MS/MS uchun rad etildi. Tayinlanmagan ionlar yoki zaryadi 1+ va >7+ bo'lganlar MS/MS uchun rad etildi. MS/MS uchun Nenaznachennye ion ili ion s zaryadom 1+ va >7+ byli otklonny. MS/MS uchun tayinlanmagan ionlar yoki 1+ va >7+ zaryadli ionlar rad etildi.míngíngíngííníínííníínínínínín 1+ mí>7+ míngíngíngínmínmínmínmínmínmín MS/MS。míngíngíngííníínííníínínínínín 1+ mí>7+ míngíngíngínmínmínmínmínmínmín MS/MS。 MS/MS uchun Neukazannye ion ili ion s zaryadami 1+ va >7+ byli otklonny. MS/MS uchun aniqlanmagan ionlar yoki 1+ va >7+ zaryadli ionlar rad etildi.
NeutrAvidin boncuklarini boyitishgacha bo'lgan namunani tayyorlash bosqichlari yuqorida tavsiflangan LC-MS/MS tahlilidagi kabi edi.Taxminan 50 mkg lizat yuklashni nazorat qilish uchun kirish sifatida ishlatilgan va 2 mg lizat bosish reaktsiyalari uchun ishlatilgan.Neytravidin bilan boyitilgan va yuvilgandan so'ng, bog'langan oqsillar agaroz qatroni boncuklariga 50 mkl Laemmli buferini qo'shib, 95 ° C da 5 daqiqa qaynatish orqali elutsiya qilindi.Nazorat yukini kiritish va boncuk bilan boyitilgan namunalar SDS-PAGE tomonidan tahlil qilindi va standart Western blot usullari bilan PVDF membranalariga (Millipore, #ISEQ00010) o'tkazildi.Membranalar 0,1% tween-20 (TBST) o'z ichiga olgan TBSda 5% yog'siz sut (Sangon, #A600669) bilan bloklangan va birlamchi va ikkilamchi antikorlar bilan ketma-ket inkubatsiya qilingan.Birlamchi antikorlar TBSTda 5% yog'siz sutda 1:1000 nisbatda suyultirildi va kechasi 4°C da inkubatsiya qilindi.Ikkilamchi antikorlar 1:5000 nisbatda ishlatilgan va xona haroratida 1 soat davomida inkubatsiya qilingan.Membranalar Chemidoc MP tasvirlash tizimidan foydalangan holda xemiluminesans orqali tasvirlangan.Rasmdagi dog'lar va jellarning kesilmagan barcha skanerlari xom ma'lumot sifatida taqdim etilgan.
Ushbu tadqiqotda ishlatiladigan asosiy antikorlar qatoriga quyon anti-SFPQ monoklonal antikor (CST, № 71992), quyon anti-FUS monoklonal antikor (CST, № 67840), quyon anti-NSUN2 poliklonal antikor (Proteintech, № 20854-1-) kiradi. AP), quyonga qarshi mSin3A poliklonal antikor (Abcam, #ab3479), sichqoncha tegiga qarshi monoklonal antikor (TransGen, #HT201-02), sichqoncha anti-b-aktin monoklonal antikor (TransGen, #HC201-01), quyonga qarshi -CDK2 monoklonal antikori (ABclonal, #A0094), CTBP1 ga quyon monoklonal antikori (ABclonal, #A11600), DUTga quyon poliklonal antikori (ABclonal, #A2901), PSMC4 ga quyon poliklonal antikori (AB2rab50-), DNAJB1 poliklonal antikor (ABclonal, # A5504).Ushbu antikorlar TBSTda 5% yog'siz sutda 1:1000 suyultirilganda ishlatilgan.Ushbu tadqiqotda ishlatiladigan ikkilamchi antikorlar orasida quyonlarga qarshi IgG (TransGen, #HS101-01), sichqonchaga qarshi IgG (TransGen, #HS201-01) 1:5000 suyultirilganda mavjud.
BRD4 ning SFPQ bilan o'zaro ta'sirini qo'shimcha tekshirish uchun HEK293Tni haddan tashqari ifodalovchi barqaror HEK293T va BRD4-miniSOG hujayralari 10 sm idishlarga qo'yilgan.Hujayralar sovuq PBS bilan yuvildi va 1 ml Pirs IP lizis tamponida (Thermo Fisher, # 87787) EDTAsiz proteaz inhibitori bilan 30 daqiqa davomida 4 ° C da lizing qilindi.Shundan so'ng, lizatlar 1,5 ml santrifüj naychalarida to'plangan va 4 ° C da 10 daqiqa davomida 15,871 xg da santrifüj qilingan.Supernatant yig'ib olindi va 5 mkg anti-V5 etiketli sichqoncha monoklonal antikori (CST, #80076) bilan kechasi 4°C da inkubatsiya qilindi.Taxminan 50 µl protein A/G magnit boncuklarini (MCE, #HY-K0202) ikki marta 0,5% Tween-20 o'z ichiga olgan PBS bilan yuving.Keyin hujayra lizatlari magnit boncuklar bilan 4 soat davomida 4 ° C da pastdan yuqoriga aylantirilgan holda inkubatsiya qilindi.Keyin boncuklar 1 ml PBST buferi bilan to'rt marta yuvildi va 95 ° C da 5 daqiqa qaynatiladi.Namunalar SDS-PAGE jellarida tahlil qilindi va standart Western blot usullaridan foydalangan holda PVDF membranalariga o'tkazildi.Membranalar TBSTda 5% yog'siz sutda bloklangan va birlamchi va ikkilamchi antikorlar bilan ketma-ket inkubatsiya qilingan.Birlamchi Antikor Quyon anti-SFPQ monoklonal antikori (CST, #71992) TBSTdagi 5% yog'siz sutda 1:1000 nisbatda qo'llanilgan va kechasi 4°C da inkubatsiya qilingan.Quyonga qarshi IgG 1:5000 nisbatda ishlatilgan va xona haroratida 1 soat davomida inkubatsiya qilingan.Membranalar Chemidoc MP tasvirlash tizimidan foydalangan holda xemiluminesans orqali tasvirlangan.
Solventga kirish mumkin bo'lgan sirt maydoni (SASA) tahlili uchun foydalanilgan barcha tuzilmalar Protein ma'lumotlar banki (PDB) 52 yoki AlphaFold oqsil strukturasi ma'lumotlar bazasidan53 olingan.FreeSASA dasturi yordamida har bir qoldiq uchun mutlaq SASA hisoblab chiqilgan.Har bir struktura uchun o'rtacha SASA ni olish uchun faqat etiketli histidin va uning qo'shnilari uchun to'liq va aniq SASA ma'lumotlari ishlatilgan.Har bir histidin uchun nisbiy erituvchiga kirish imkoniyati (RSA) mutlaq SASA qiymatini erituvchi uchun mavjud bo'lgan empirik maksimal mumkin bo'lgan qoldiq sirt maydoniga bo'lish yo'li bilan hisoblab chiqilgan.O'rtacha RSA 20% dan past bo'lsa, barcha histidinlar yashirin deb tasniflanadi, aks holda ochiq bo'ladi56.
DDA rejimida olingan xom fayllar Proteome Discoverer (v2.5) yoki MSfragger (Fragpipe v15.0) yordamida umumiy ifloslantiruvchi moddalarni o'z ichiga olgan tegishli SwissProt tomonidan tasdiqlangan protein ma'lumotlar bazasida qidirildi.Peptidlar ikkita etishmayotgan bo'linish joyiga ega to'liq tripsinni, qattiq modifikatsiya sifatida karbamoil metilatsiyasini va dinamik modifikatsiya sifatida metionin oksidlanishini talab qildi.Prekursor va fragment og'irligi tolerantliklari mos ravishda 10 ppm va 0,02 Da (MS2 Orbitrap) ga o'rnatildi. Ifloslantiruvchi moddalar olib tashlandi va <1% noto'g'ri aniqlash tezligini olish uchun oqsillar filtrlandi. Ifloslantiruvchi moddalar olib tashlandi va <1% noto'g'ri aniqlash tezligini olish uchun oqsillar filtrlandi. Popadaniya zagryaznyayushchix veshchetv byli udaleny, a belki otfiltrovani, chtoby poluchit koeffitsienti obnarujeniya <1%. Noto'g'ri aniqlash darajasi <1% bo'lishi uchun ifloslantiruvchi moddalar olib tashlandi va oqsillar filtrlandi.língíngíngíngínínínínì, língíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngínjínjínjíngínjīng. <1% língjínjínjín. Popadaniya zagryaznyayushchix veshchetv byli udaleny, a belki otfiltrovany uchun dostijeniya urovnya lozhnyx obnarujeniy <1%. Ifloslantiruvchi zarbalar olib tashlandi va <1% noto'g'ri ijobiy stavkaga erishish uchun oqsillar filtrlandi.Yorliqlardan foydalanmasdan miqdoriy tahlil qilish uchun uchta biologik takrorlashdan normallashtirilgan protein tarkibi ishlatilgan.Proteinning hujayra osti lokalizatsiyasi tahlili DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 va Elis Ting guruhi tomonidan tuzilgan va nashr etilgan ma'lumotlar bazalaridan Gen Ontologiyasi (GO) tahlili yordamida amalga oshirildi.Vulqon xaritasi Perseusdan olingan (v1.6.15.0). Protein ko'pligidagi o'zgarishlar ikki tomonlama t-test yordamida statistik ahamiyatga ega bo'lish uchun sinovdan o'tkazildi va oqsil zarbalari ko'plik o'zgarishi > 2 (agar boshqacha ko'rsatilmagan bo'lsa) va p qiymati <0,05 bilan aniqlandi. Protein ko'pligidagi o'zgarishlar ikki tomonlama t-test yordamida statistik ahamiyatga ega bo'lish uchun sinovdan o'tkazildi va oqsil zarbalari ko'plik o'zgarishi > 2 (agar boshqacha ko'rsatilmagan bo'lsa) va p qiymati <0,05 bilan aniqlandi. Izmeneniya kratnosti soderjaniya belka byli provereny na statistikcheskuyu znachimost s ispolzovanie dvustoronnego t-kriteriya, va sovpadeniya belkov byli identifikatsiyalash s izmenenem soderjaniya> 2 (esli ne ukazano inoe) va p <0, p <0, 5. Protein tarkibidagi qatlam o'zgarishlari ikki dumli t-testi yordamida statistik ahamiyatga ega bo'lish uchun sinovdan o'tkazildi va protein mosliklari kontent o'zgarishi > 2 (agar boshqacha ko'rsatilmagan bo'lsa) va ap qiymati <0,05 bilan aniqlandi.① ② ③ ④ shǒu àixi - 确定 确定 确定 确定 确定 确定 确定 确定 确定 确定 确定 确定 确定 中 中 确定 中 中 中 中 中 中 中 的 中 中 中 中 的 中 ↓ ↑① ② ③ ④ shǒuwàn 变化 命 命 命 命 命 变化 变化 变化 变化 变化 命 变化 变化 变化 变化 变化 的 的 ↑, 2 (↓ ↑) ↓ 0.05. Statistika znachimost kratnyx izmeneniy soderjaniya belka proveryali s ispolzovaniem dvustoronnego t-kriteriya, a sovpadeniya belkov opredelyali uchun izmeneniy soderjaniya >2 (esli ne ukazano inoe) va p-znacheniy <0,05. Protein tarkibidagi qatlam o'zgarishlarining statistik ahamiyati ikki dumli t-test yordamida sinovdan o'tkazildi va tarkibidagi o'zgarishlar > 2 (agar boshqacha ko'rsatilmagan bo'lsa) va p-qiymatlari <0,05 uchun oqsil mosligi aniqlandi.Protein o'zaro ta'siri tahlili String ma'lumotlar bazasi bilan birga GO tahlili yordamida amalga oshirildi.
Xuddi shunday natijalar bilan uchta biologik takrorlash amalga oshirildi.Statistik tahlil GraphPad Prism (GraphPad dasturi) yordamida amalga oshirildi va Perseus (v1.6.15.0) yordamida vulqon uchastkalari yaratildi.Ikki guruhni solishtirish uchun p-qiymatlari ikki dumli Student t-testi yordamida aniqlandi.Eksperimental guruhda kamida ikki marta aniqlangan yagona oqsillar vulqon uchastkalariga kiritilgan va nazorat guruhidagi tegishli etishmayotgan qiymatlar p-qiymatini hisoblash uchun normal taqsimotdan Perseus bilan almashtirilgan.Xato satrlari o'rtacha ± standart og'ishni ifodalaydi.Statistik tahlil uchun proteomik tahlillarda kamida ikkita biologik replikatsiyada paydo bo'lgan oqsillarning ko'pligi saqlanib qoldi.Namuna hajmini oldindan aniqlash uchun statistik usullar qo'llanilmadi.Tajribalar tasodifiy emas.Tadqiqotchilar eksperiment va natijalarni baholashda topshiriqlarga ko'r bo'lishmadi.
Tadqiqot dizayni haqida ko'proq ma'lumot olish uchun ushbu maqolaga havola qilingan Tabiatni o'rganish hisobotiga qarang.
Ushbu tadqiqotda olingan massa spektrometriya ma'lumotlari ProteomeXchange Konsortsiumiga iProX57 hamkorlar ombori orqali ID PXD034811 (PDPL-MS ma'lumotlar to'plami) ma'lumotlar to'plami ostida taqdim etildi.Xom ma'lumotlar xom ma'lumotlar fayllari shaklida taqdim etiladi.Ushbu maqola asl ma'lumotlarni taqdim etadi.
Gngras, AC, Abe, KT & Raught, B. Qo'shnichilik bilan tanishish: oqsil komplekslarini tavsiflash va organellalarni xaritalash uchun yaqinlikka bog'liq biotinilatsiyadan foydalanish. Gngras, AC, Abe, KT & Raught, B. Qo'shnichilik bilan tanishish: oqsil komplekslarini tavsiflash va organellalarni xaritalash uchun yaqinlikka bog'liq biotinilatsiyadan foydalanish.Gingrash, AS, Abe, KT va Raut, B. Atrof bilan tanishish: oqsil komplekslarini va xarita organellalarini tavsiflash uchun yaqinlikka bog'liq biotinilatsiyadan foydalanish. Gngras, AC, Abe, KT & Raught, B. Gngras, AC, Abe, KT & Raught, B. Qo'shnichilikni tushunish: mahallaning biologik hayotga bog'liqligidan foydalaning.Gingras, AS, Abe, KT va Raut, B. Yaqinlikni tushunish: oqsil komplekslarini tavsiflash va yaqinlikka bog'liq biotinilatsiya yordamida organellalarni xaritalash.Hozirgi.Mening fikrim.Kimyoviy.biologiya 48, 44–54 (2019).
Geri, JB va boshqalar.Dexter energiyasini immunitet hujayralariga o'tkazish orqali mikro muhitni xaritalash.Fan 367, 1091–1097 (2020).
Hertling, EL va boshqalar.Ikki proteom masshtabli tarmoqlar inson interaktomining hujayraga xos qayta tuzilishini aniqlaydi.Hujayralar 184, 3022–3040.e3028 (2021).