Yangiliklar

Yuqumli kasalliklarni aniqlashning an'anaviy diagnostika strategiyalari tibbiy yordam ko'rsatish punkti (POCT) uchun mos bo'lmagan dastgoh asboblaridan foydalanishni talab qiladi.Rivojlanayotgan mikrofluidika - bu juda miniatyuralashtirilgan, avtomatlashtirilgan va integratsiyalashgan texnologiya bo'lib, tez, arzon narxlardagi va aniq tashxis qo'yish uchun an'anaviy usullarga potentsial muqobildir.Molekulyar diagnostika usullari patogenni aniqlashning eng samarali usullari sifatida mikrosuyuqlik qurilmalarida keng qo'llaniladi.Ushbu sharh akademik va sanoat nuqtai nazaridan yuqumli kasalliklarning mikrofluidlarga asoslangan molekulyar diagnostikasida so'nggi yutuqlarni umumlashtiradi.Birinchidan, biz nuklein kislotalarning odatdagi chipda ishlov berish jarayonini tasvirlaymiz, jumladan namunani oldindan tozalash, kuchaytirish va signalni o'qish.Keyin to'rt turdagi mikrosuyuq platformalarning xususiyatlari, afzalliklari va kamchiliklari taqqoslanadi.Keyinchalik, nuklein kislotalarning mutlaq miqdorini aniqlash uchun raqamli tahlillardan foydalanishni muhokama qilamiz.Klassik va yaqinda ishlab chiqarilgan mikrosuyuqlikka asoslangan molekulyar diagnostika asboblari bozorning hozirgi holatining dalili sifatida umumlashtiriladi.Va nihoyat, biz yuqumli kasalliklarning mikrofluidik diagnostikasi bo'yicha kelajakdagi yo'nalishlarni taklif qilamiz.
Yuqumli kasalliklar butun dunyo bo'ylab tarqalgan patogenlar, jumladan, bakteriyalar, viruslar va parazitlardan kelib chiqadi.Boshqa kasalliklardan farqli o'laroq, patogenlar tezda yuqadi va emlash, havo va suv muhiti orqali odamlar va uy hayvonlari o'rtasida tarqaladi [1].Yuqumli kasalliklarning oldini olish jamoat salomatligini muhofaza qilish chorasi sifatida juda muhimdir.Yuqumli kasalliklarga qarshi kurashning uchta asosiy strategiyasi: (1) infektsiya manbasini nazorat qilish;(2) uzatish yo'lining uzilishi;(3) sezgir populyatsiyalarni himoya qilish.Asosiy strategiyalar orasida infektsiya manbasini nazorat qilish qulayligi va arzonligi tufayli eng muhim strategiya hisoblanadi.Infektsiyalangan shaxslarni tezkor diagnostika qilish, izolyatsiya qilish va davolash juda muhim, bu tez, sezgir va aniq diagnostika strategiyalarini talab qiladi [2].Yuqumli kasalliklarning hozirgi diagnostikasi odatda belgilar va alomatlarga asoslangan klinik tekshiruvni va hujayra madaniyati va molekulyar diagnostika kabi laboratoriya tadqiqotlarini birlashtiradi, bu esa o'qitilgan xodimlarni, ko'p mehnat talab qiladigan protseduralarni va qimmat sinov uskunalarini talab qiladi [3, 4].Yuqumli kasalliklar tarqalishining oldini olish, ayniqsa, yuqumli kasalliklar keng tarqalgan va og'ir [5] bo'lgan resurslar cheklangan hududlarda tez, arzon va aniq mahalliy tashxisni, shuningdek, favqulodda vaziyatlarni oldindan aytib bo'lmaydigan cho'lda yoki jang maydonida davolashni talab qiladi..tibbiy yordam cheklangan [6].Shu nuqtai nazardan, mikrofluidika - bu suyuqlikni aniq manipulyatsiya qilish uchun mikroelektromexanik tizimlar texnologiyalarini, nanotexnologiyani yoki materialshunoslikni birlashtirgan texnologiya [7,8,9,10], yordam nuqtasini aniqlash (POCT) uchun yangi imkoniyatlarni taqdim etadi.) kasalxonalar va laboratoriyalardan tashqarida yuqumli kasalliklar.An'anaviy ko'p vaqt talab qiluvchi diagnostika bilan solishtirganda, mikrofluidik texnologiya kasallikning tarqalishi paytida molekulyar diagnostika uchun namuna va xarajatlarni tejash imkonini beradi.Koronavirus kasalligi 2019 (COVID-19) ning global tarqalishi 2-koronavirus (SARS-CoV-2) og'ir o'tkir respirator sindromi tufayli yuzaga keladi, shuning uchun pandemiyaning o'z vaqtida oldini olish va nazorat qilish uchun mikrofluidiklarning ahamiyati yana bir bor ta'kidlanadi [11, 12] , 13].An'anaviy diagnostikadan farqli o'laroq, mikrofluidik POCT namuna olish nuqtasi yaqinida sinov qilish uchun stol usti analizatorlaridan tortib kichik yon oqim sinov chiziqlarigacha bo'lgan kichik portativ qurilmalardan foydalanadi [14].Ushbu testlar namunani oddiy yoki yo'q tayyorlash, tezkor signalni kuchaytirish va sezgir signal o'qishlarini o'z ichiga oladi, natijada qisqa muddat va bir necha daqiqada aniq natijalarga erishiladi.Mikrofluidga asoslangan sog'liqni saqlash vositalarining mavjudligi va ommaviy ishlab chiqarilishi shifoxonadan tashqarida, bemorning yonida va hatto uyda ham tejamkor va to'g'ridan-to'g'ri diagnostika dasturlarini kengaytirdi.
Yuqumli kasalliklar diagnostikasi uchun mavjud strategiyalar orasida molekulyar diagnostika eng sezgirlaridan biridir [15, 16].Bundan tashqari, molekulyar diagnostika ko'pincha immunitet reaktsiyasi boshlanishidan oldin RNK yoki DNKning virusga xos hududlarini to'g'ridan-to'g'ri aniqlash imkonini beruvchi COVID-19 ni doimiy aniqlash uchun oltin standart sifatida ishlatiladi [17, 18].Joriy sharhda biz yuqumli kasalliklar uchun mikrofluidikaga asoslangan molekulyar diagnostika jarayonlaridagi so'nggi yutuqlarni, akademik nuqtai nazardan kelajak sanoat istiqbollarigacha taqdim etamiz (1-rasm).Biz nuklein kislotani aniqlashning uchta asosiy bosqichidan boshlaymiz: namunani chipda oldindan tozalash, nuklein kislotani kuchaytirish va signalni o'qish.Keyin biz har xil turdagi mikrofluid platformalarini ularning tuzilishi va funktsiyalari bilan solishtirdik, ular o'ziga xos xususiyatlarni (kuchli va zaif tomonlarini) ko'rsatdi.Raqamli nuklein kislotani aniqlash qo'shimcha muhokama qilinadi va yuqumli patogen molekulalarning mutlaq miqdorini aniqlash uchun uchinchi avlod texnologiyasiga misol sifatida beriladi.Bundan tashqari, molekulyar diagnostika uchun mikrofluidik POCT bozorining hozirgi holatini ko'rsatish uchun bir nechta tipik va so'nggi tijorat POCT qurilmalari taqdim etiladi.Shuningdek, biz kelajakdagi ilovalar uchun qarashlarimizni muhokama qilamiz va tushuntiramiz.
Nuklein kislotani aniqlash uchun mikrosuyuq mikrosxemalar modullarini vazifalariga ko'ra uch toifaga (namuna olish, tanib olish va signalizatsiya) bo'lish mumkin [19].Ushbu modullar orasida namuna olish moduli asosan namuna lizisini va nuklein kislota ekstraktsiyasini amalga oshiradi.Sensor moduli asosan nuklein kislota signallarini konvertatsiya qilish va kuchaytirishni nazorat qiladi.Signal moduli sensor moduli tomonidan o'zgartirilgan va qayta ishlangan signalni aniqlaydi.Chipdagi nuklein kislotalarni aniqlash jarayoniga asoslanib, biz "kirish va chiqish" funktsiyasini amalga oshirishi mumkin bo'lgan turli chiplarni umumlashtiramiz.
Nuklein kislotani aniqlashning birinchi bosqichi nuklein kislota ekstraktsiyasidir, ya'ni maqsadli nuklein kislotani dastlabki namunadan ajratib olishdir.Nuklein kislota ekstraktsiyasi nuklein kislotalarni boshqa molekulyar ifloslantiruvchi moddalardan tozalash, nuklein kislota molekulalarining birlamchi tuzilishining yaxlitligini ta'minlash va natijalarni optimallashtirish uchun amalga oshiriladi.Nuklein kislotasi ekstrakti zarur namuna lizisini va nuklein kislotani ushlashni talab qiladi, ularning sifati va samaradorligi tadqiqot va diagnostika natijalariga katta ta'sir ko'rsatadi.Ekstraksiya paytida har qanday nozik nojo'ya ta'sirlar keyingi aniqlashni cheklashi mumkin.Misol uchun, polimeraza zanjiri reaktsiyasi (PCR) va pastadir izotermik kuchaytirish (LAMP) usullari nuklein kislota izolyatsiyalash reagentlarida etanol va izopropanol kabi ba'zi qoldiq organik erituvchilar tomonidan inhibe qilinadi [20].Suyuq-suyuqlik ekstraktsiyasi va qattiq fazali ekstraktsiya nuklein kislotalarni ajratishning eng mashhur usullaridir [21], ammo chipda suyuqlik-suyuqlik ekstraktsiyasi juda cheklangan, chunki suyuqlik-suyuqlik ekstraktida ishlatiladigan reagentlar ko'pchilik mikrosuyuqlik chiplarining korroziyasini keltirib chiqaradi. .Bu erda biz mikroarray asosidagi qattiq fazali ekstraktsiya usullarini ta'kidlaymiz va ularning afzalliklari va kamchiliklarini solishtiramiz.
Silikon biomosligi, barqarorligi va modifikatsiya qilish qulayligi tufayli nuklein kislotalar bilan mos keladigan substrat materialidir [22].Muhimi, kremniy oksidi yoki boshqa materiallar bilan o'zgartirilganda, bu kompozitsion yuqori pH, past tuzli eritmalar bilan elutatsiya qilinganda, past pH, yuqori tuz sharoitida salbiy zaryadlangan nuklein kislotalarni adsorbsiyalash xususiyatlarini namoyish etadi.Ushbu hodisaga asoslanib, nuklein kislotani tozalash mumkin.
Mikrofluidlarda nuklein kislotalarni olish uchun kremniy bo'nchalari, kukunlar, mikrofiber filtrlar va silika membranalari kabi silika asosidagi materiallarning turli shakllari ishlatilgan [23, 24, 25, 26].Materialning xususiyatlariga qarab, kremniy asosidagi materiallar mikrosxemalarda turli usullarda qo'llanilishi mumkin.Masalan, silika granulalari, kukunlari va tijorat nanofiltrlari oddiygina mikrosuyuq chiplarning teshiklari yoki mikrokanallariga joylashtirilishi va namunalardan nuklein kislotalarni ajratib olishga yordam beradi [27, 28, 29].Yuzaki modifikatsiyalangan silika membranalari DNKni patogenlardan arzon narxlarda tez tozalash uchun ham ishlatilishi mumkin.Masalan, Vang va boshqalar.[30] Denaturatsiya qiluvchi kuchaytiruvchi reaktsiyalarni vesikulyar vositachi zanjir almashinuvi bilan xitozan oligosakkaridlari bilan qoplangan silika membranalari bilan birlashtirib, 102-108 koloniya hosil qiluvchi birliklarni muvaffaqiyatli aniqlagan ko'p qirrali portativ tizim joriy etildi.(CFU)/ml Vibrio parahaemolyticus., va virusning mavjudligi osongina ko'rinib turardi.Pauell va boshqalar.[31] Keyinchalik gepatit C virusi (HCV), odamning immunitet tanqisligi virusi (OIV), Zika virusi va inson papillomavirusini aniqlash uchun kremniy asosidagi mikroarraylar ishlatilgan va RNK viruslarini ushlash uchun 1,3 mkl burilishli mikroreaktor ishlab chiqilgan.va in situ kuchaytirishni amalga oshiring.Ushbu usullarga qo'shimcha ravishda, sirt o'zgartirilgan kremniy mikrokolonkalari ham nuklein kislotani olishda asosiy rol o'ynaydi, chunki modifikatsiya qiluvchi materialning geometriyasi va xususiyatlari ekstraktsiya samaradorligini sezilarli darajada oshiradi.Chen va boshqalar.[32] aminokislotalar bilan qoplangan kremniy mikrokolonkalar asosida past konsentratsiyali RNKni izolyatsiya qilish uchun mikrofluidik platformani taklif qildi.Ushbu mikrosuyuqlik qurilmasi yuqori sirt maydoni va hajm nisbati dizayni orqali yuqori ekstraksiya samaradorligiga erishish uchun kremniy substratda 0,25 sm2 mikroprillar qatorini birlashtiradi.Ushbu dizaynning afzalligi shundaki, mikrofluidik qurilma 95% gacha nuklein kislota olish samaradorligiga erisha oladi.Ushbu kremniyga asoslangan strategiyalar nuklein kislotalarni arzon narxlarda tez izolyatsiya qilish qiymatini ko'rsatadi.Mikrofluidik chiplar bilan birgalikda kremniy asosidagi ekstraksiya strategiyalari nafaqat nuklein kislotani aniqlash samaradorligini oshirishi, balki analitik qurilmalarni miniatyuralashtirish va integratsiyalashuvini ham osonlashtirishi mumkin [20].
Magnit ajratish usullari tashqi magnit maydon mavjudligida nuklein kislotalarni ajratib olish uchun magnit zarralardan foydalanadi.Keng qoʻllaniladigan magnit zarralar qatoriga silika, amino va karboksil bilan qoplangan Fe3O4 yoki g-Fe2O3 magnit zarrachalari kiradi [33,34,35,36].Magnit zarrachalarning kremniy asosidagi SPE usullari bilan solishtirganda ajralib turadigan xususiyati tashqi magnitlar bilan manipulyatsiya va nazorat qilish qulayligidir.
Nuklein kislotalar va kremniy dioksidi o'rtasidagi elektrostatik o'zaro ta'sirdan foydalanib, yuqori tuz va past pH sharoitida nuklein kislotalar silika bilan qoplangan magnit zarrachalar yuzasida adsorbsiyalanadi, past tuz va yuqori pH sharoitida molekulalar yuvilishi mumkin. yana..Silika bilan qoplangan magnit boncuklar magnit bilan boshqariladigan harakat yordamida katta hajmli namunalardan (400 mkl) DNKni ajratib olish imkonini beradi [37].Namoyish sifatida, Rodriguez-Mateos va boshqalar.[38] magnit boncuklarning turli kameralarga o'tkazilishini nazorat qilish uchun sozlanishi magnitlardan foydalangan.Silika bilan qoplangan magnit zarralar asosida LAMP teskari transkripsiyani aniqlash (RT-LAMP) uchun oqava suv namunalaridan 470 nusxa/ml SARS-CoV-2 genomik RNK olinishi mumkin va javob 1 soat ichida o‘qilishi mumkin.yalang'och ko'z (2a-rasm).
Magnit va gözenekli materiallarga asoslangan qurilmalar.SARS-CoV-2 RNKni aniqlash uchun IFAST RT-LAMP mikrosuyuqlik qurilmasining kontseptual diagrammasi ([38] dan moslangan).b Bukkal tampon nuklein kislotasining dSPE uchun santrifüj mikro qurilma ([39] dan moslashtirilgan).c FTA® kartasi yordamida o'rnatilgan o'z-o'zidan ishlaydigan namuna kontsentratori ([50] dan moslashtirilgan).d Xitozan bilan modifikatsiyalangan Fusion 5 filtr qog'ozi ([51] dan moslangan).SARS-CoV-2 og'ir o'tkir respirator sindromi coronavirus 2, RT-LAMP teskari transkripsiya zanjiri vositachiligida izotermik kuchaytirish, FTA topuvchilari texnologiya hamkorlari, NA nuklein kislotasi
Ijobiy zaryadlangan magnit zarralar nuklein kislotaning fosfat magistralini biriktirish uchun idealdir.Muayyan tuz konsentratsiyasida nuklein kislotalarning manfiy zaryadlangan fosfat guruhlari magnit kompozit zarrachalar yuzasida musbat zaryadlangan bo'lishi mumkin.Shuning uchun nuklein kislotalarni olish uchun sirt qo'pol va yuqori zichlikdagi aminokislotalar bo'lgan magnit nanozarrachalar ishlab chiqilgan.Magnit ajratish va blokirovkadan so'ng magnit nanozarrachalar va DNK komplekslari to'g'ridan-to'g'ri PCRda qo'llanilishi mumkin, bu murakkab va ko'p vaqt talab qiladigan tozalash va elutsiya operatsiyalariga ehtiyojni yo'q qiladi [35].Manfiy karboksil guruhlari bilan qoplangan magnit nanozarrachalar yuqori konsentratsiyali polietilen glikol va natriy xlorid eritmalarida yuzalarga adsorbsiyalangan nuklein kislotalarni ajratish uchun ham ishlatilgan [36].Ushbu sirt o'zgartirilgan magnit boncuklar bilan DNK ekstraktsiyasi keyingi kuchaytirish bilan mos keladi.Dignan va boshqalar.[39] nuklein kislotani oldindan tozalash uchun avtomatlashtirilgan va koʻchma santrifüjli mikrosuyuqlik platformasini tasvirlab berdi, bu esa texnik boʻlmagan xodimlarga uni joyida ishlatish imkonini beradi.Bundan tashqari, ajratilgan DNKning LAMP bilan muvofiqligi, nuklein kislotani parvarish qilish nuqtasida tahlil qilish uchun juda mos bo'lgan usul, qo'shimcha ravishda minimal jihoz talablarini va kolorimetrik tahlillar uchun yaroqliligini ko'rsatadi (2b-rasm).
Magnit boncuk usullari avtomatlashtirilgan ekstraksiya qilish imkoniyatini taklif qiladi, ularning ba'zilari tijorat avtomatlashtirilgan nuklein kislotasi ekstraktorlarida mavjud [KingFisher;ThermoFisher (Waltham, MA, AQSH), QIAcube® HT;CapitalBio (Pekin, Xitoy) va Biomek®;Bekman (Mayami, AQSh).), Florida, AQSh)].Magnit boncuklarni mikrofluidlar bilan birlashtirishning afzalliklari nuklein kislotalarning samarali avtomatlashtirilgan ekstraktsiyasi uchun ishlatilishi mumkin, bu molekulyar diagnostikaning rivojlanishini potentsial ravishda ilgari surishi mumkin;ammo, magnit boncuklar mikrofluidics bilan birikmasi hali ham magnit boncuklar aniq manipulyatsiyasi uchun murakkab nazorat qilish tizimlariga katta tayanib, bu tijorat mahsulotlari ommaviyligini tushuntiradi katta va qimmat bo'lib, POCT magnit boncuklar keyingi qo'llanilishini cheklaydi.
Nuklein kislotani aniqlash uchun modifikatsiyalangan nitroselüloza filtrlari, Finders Technology Associates (FTA) kartalari, polietersulfon asosidagi filtr qog'ozlari va glikan bilan qoplangan materiallar kabi bir nechta gözenekli materiallar ham ishlatilgan [40, 41, 42, 43, 44].Tolali qog'oz kabi g'ovakli tolali materiallar birinchi bo'lib uzun ipli DNK molekulalarini tolalar bilan jismonan bog'lash orqali DNKni ajratish uchun ishlatilgan.Kichik teshiklar DNK molekulalarining kuchli jismoniy cheklanishiga olib keladi, bu esa DNK ekstraktsiyasiga ijobiy ta'sir qiladi.Tolali qog'ozning turli xil g'ovak o'lchamlari tufayli ekstraktsiya samaradorligi DNKni kuchaytirish ehtiyojlarini qondira olmaydi [45, 46].FTA kartasi sud tibbiyoti sohasida qo'llaniladigan va molekulyar diagnostikaning boshqa sohalarida keng qo'llaniladigan tijorat filtr qog'ozidir.Namunadagi hujayra membranalarini parchalash uchun turli xil kimyoviy moddalar bilan singdirilgan tsellyuloza filtr qog'ozidan foydalanish orqali chiqarilgan DNK 2 yilgacha parchalanishdan himoyalangan.Yaqinda singdirilgan tsellyuloza qog'ozi turli patogenlarni, jumladan SARS-CoV-2, leyshmanioz va bezgakni molekulyar aniqlash uchun ishlab chiqilgan [47,48,49].Izolyatsiya qilingan plazmadagi OIV to'g'ridan-to'g'ri parchalanadi va virusli nuklein kislota konsentratorga o'rnatilgan FTA® oqim membranasida boyitiladi, bu nuklein kislotani samarali ishlab chiqarish imkonini beradi [50] (2c-rasm).FTA kartalari yordamida nuklein kislotani aniqlashning asosiy muammosi shundaki, guanidin va izopropanol kabi kimyoviy moddalar keyingi kuchaytirish reaktsiyalarini inhibe qiladi.Ushbu muammoni hal qilish uchun biz DNK molekulalari va tolali filtr qog'ozining jismoniy o'zaro bog'lanishi va nuklein kislotasining yuqori samarali ekstraktsiyasiga erishish uchun DNKning xitosan bilan o'zgartirilgan birikmalarga elektrostatik adsorbsiyasi afzalliklarini birlashtirgan Fusion 5 xitosan bilan o'zgartirilgan filtr qog'ozini ishlab chiqdik. ..filtr tolalari [51] (2d-rasm).Xuddi shunday, Zhu va boshqalar.[52] Zika virusi RNKsini tez izolyatsiya qilish va aniqlash uchun in situ kapillyar mikrosuyuqlik tizimiga asoslangan xitosan bilan modifikatsiyalangan PCR usulini namoyish etdi.Nuklein kislotalar aralash lizat/PCR muhitida mos ravishda xitozanni yoqish/o‘chirish xususiyatiga qarab adsorbsiyalanishi/desorbsiyalanishi mumkin.yoqish va o'chirish", pH ga javob beradi.
Yuqorida aytib o'tilganidek, bu strategiyalar turli xil qattiq fazali materiallarning afzalliklarini birlashtiradi va mikrofluidlarda nuklein kislotasini olish samaradorligini oshiradi.Amaliy qo'llanmalarda ushbu materiallardan katta miqdorda foydalanish tejamkor emas va bu materiallar bilan to'g'ri sirt ishlov berish yoki umumiy materiallarning sirtini o'zgartirish ham ularning funktsiyalarini saqlab qolishi mumkin.Shu sababli, tajribaviy tadqiqotdan so'ng ushbu strategiyalarni amalga oshirish xarajatlarni kamaytirishi mumkin, deb ishoniladi.
Mikrosuyuq platformalarda nuklein kislota sinovi ko'pincha kichik namuna hajmlaridan (<100 µl) foydalanadi, shuning uchun quyi oqimni aniqlash uchun qulay bo'lgan signalga aylantirish uchun maqsadli nuklein kislotalarni maxsus zondlar bilan kuchaytirishni talab qiladi (optik, elektr va magnit) [53, 54]. Mikrosuyuq platformalarda nuklein kislota sinovi ko'pincha kichik namuna hajmlaridan (<100 µl) foydalanadi, shuning uchun quyi oqimni aniqlash uchun qulay bo'lgan signalga aylantirish uchun maqsadli nuklein kislotalarni maxsus zondlar bilan kuchaytirishni talab qiladi (optik, elektr va magnit) [53, 54]. test sinovlari5, nukleinovyx kislot na mikrojidkostnyx platformax chastoy ispolzuyutsya nebolshie ob'emy obraztsov (< 100 mkl), poetomu trebuetsya amplifikatsiya tselevyx nukleinovyh kislot va pomoshchju maxsus signalizatsiya zonalari uchun elektr tokini 3 ta'minlash. Nuklein kislotalarni mikrosuyuq platformalarda sinovdan o'tkazishda ko'pincha kichik namuna hajmlari (<100 µL) qo'llaniladi, shuning uchun maqsadli nuklein kislotalarni maxsus zondlar yordamida kuchaytirish, uni keyingi aniqlash (optik, elektr va magnit) uchun qulay signalga aylantirish uchun talab qilinadi. [53, 54].① ② ③ ④ (<100 mkl), 因此 需要 需要 需要 转换 核酸 转换 转换 转换 转换 转换 转换 转换 检测 转换 转换 转换 检测 ↑ ].① ② ③ ④ ((<100 mkl), 因此 需要 需要 转换 转换 转换 转换 转换 转换 转换 下游 转换 ↑ [23,54, 54, 54 ]. Obnarujenie nukleinovyh kislot na mikrojidkostnyx platformax obychno ispolzuet nebolshie ob'emy obraztsov (<100 mkl), chto trebuet amplifikatsii celevyx nukleinovyx kislot sm pomoshchyu maxsus elektr uzatish zonasi (5 uchun elektr signalizatsiyasi5) uchun zarurdir. Mikrofluid platformalarida nuklein kislotalarni aniqlash odatda kichik namuna hajmlaridan (<100 mkl) foydalanadi, bu esa maqsadli nuklein kislotalarni keyingi aniqlash (optik, elektr va magnit) uchun signallarga aylantirish uchun maxsus zondlar yordamida kuchaytirilishini talab qiladi [53, 54]] .Mikrofluidlarda nuklein kislotani kuchaytirish ham reaksiyalarni tezlashtirishi, aniqlash chegaralarini optimallashtirishi, namuna talablarini kamaytirishi va aniqlashning aniqligini oshirishi mumkin [55, 56].So'nggi yillarda tez va to'g'ri aniqlashning amalga oshirilishi bilan mikrofluidlarda, jumladan PCR va ba'zi izotermik kuchaytirish reaktsiyalarida nuklein kislotalarni kuchaytirish usullari qo'llanildi.Ushbu bo'limda mikrosuyuqlik tizimlariga asoslangan nuklein kislotalarni aniqlash usullari umumlashtiriladi.
PCR - bu organizmning DNK replikatsiyasi jarayonining simulyatsiyasi, uning nazariyasi boshqa joyda batafsil tavsiflangan va bu erda muhokama qilinmaydi.PCR juda oz miqdordagi maqsadli DNK/RNKni eksponensial tezlikda kuchaytirishi mumkin, bu esa PCRni nuklein kislotalarni tezkor aniqlash uchun kuchli vositaga aylantiradi.So'nggi o'n yilliklarda tibbiy diagnostika ehtiyojlarini qondirish uchun PCR termal tsikli tizimlari bilan jihozlangan ko'plab portativ mikrofluidik qurilmalar ishlab chiqildi [57, 58].Haroratni nazorat qilishning turli usullariga ko'ra, chipdagi PCR to'rt turga bo'linishi mumkin (an'anaviy, uzluksiz oqim, fazoviy o'zgaruvchan va konvektiv PCR) [59].Masalan, Gee va boshqalar.[60] SARS-CoV-2, gripp A va B viruslarini tomoq tampon namunalarida multipleks aniqlash uchun o'zlarining mikrofluid platformasida to'g'ridan-to'g'ri teskari transkripsiyali miqdoriy PCR (RT-qPCR) usulini ishlab chiqdilar (3a-rasm).Park va boshqalar.[61] yupqa plyonkali PCR, elektrodlar va barmoq bilan boshqariladigan polidimetilsiloksanga asoslangan mikrofluidik modulni birlashtirib, oddiy patogen tahlil chipini yaratdi.Biroq, ikkala asar ham an'anaviy PCRning umumiy kamchiliklarini o'zida mujassam etgan.PCR termal tsiklni talab qiladi, bu esa qurilmaning keyingi miniatyurasini cheklaydi va sinov vaqtini qisqartiradi.
Ushbu muammoni hal qilish uchun doimiy oqimga asoslangan mikrosuyuqlik va fazoviy o'tish PCRni ishlab chiqish juda muhimdir.Uzoq serpantin kanali yoki qisqa to'g'ri kanaldan foydalangan holda, doimiy oqim PCR reagentlarni chipdan tashqari nasos bilan uchta oldindan qizdirish zonasida faol ravishda aylanib, tez kuchaytirilishini ta'minlaydi.Bu operatsiya turli reaksiya haroratlari orasidagi o'tish bosqichidan muvaffaqiyatli qochib, sinov vaqtini sezilarli darajada qisqartiradi [62] (3b-rasm).Jung va boshqalarning boshqa tadqiqotida.[63] ultrafast va multipleks teskari transkripsiyali PCR uchun sobit va oqimli PCR xususiyatlarini birlashtirgan yangi aylanadigan PCR genetik analizatorini taklif qildi (3c-rasm).Nuklein kislotani kuchaytirish uchun PCR mikrochipi turli haroratlarda uchta isitish bloki orqali aylantiriladi: 1. Denaturatsiya bloki 94°C, 2. 58°C da yumshatish bloki, 3. 72°C da kengaytirish bloki.
Mikrofluidikada PCRni qo'llash.Mikrofluidik platformada dirRT-qPCR ning sxematik tasviri ([60] dan moslashtirilgan).b Serpantin kanaliga asoslangan uzluksiz oqim PCR mikroarrayining sxematik tasviri ([62] dan moslashtirilgan).c Mikrochip, uchta isitish bloki va step motoridan iborat aylanma PCR genetik analizatorining sxematik tasviri ([63] dan moslashtirilgan).d Santrifüjlash va sozlash bilan termokonveksiyali PCR diagrammasi ([64] dan moslashtirilgan).DirRT-qPCR, to'g'ridan-to'g'ri miqdoriy teskari transkripsiya polimeraza zanjiri reaktsiyasi
Kapillyarlar va halqalar yoki hatto yupqa plitalardan foydalangan holda, konveksiya PCR tashqi nasossiz tabiiy erkin termal konvektsiya orqali nuklein kislotalarni tezda kuchaytirishi mumkin.Misol uchun, siklik olefin polimer mikrosuyuqlik platformasi PCR halqa mikrokanalida santrifüjlash bilan termal aylanishdan foydalanadigan ishlab chiqarilgan aylanadigan isitish bosqichida ishlab chiqilgan [64] (3d-rasm).Reaksiya eritmasi halqasimon tuzilishga ega mikrokanalda yuqori va past haroratni doimiy ravishda almashinadigan termal konveksiya bilan harakatga keltiriladi.Butun kuchaytirish jarayoni 70,5 pg/kanal aniqlash chegarasi bilan 10 daqiqada yakunlanishi mumkin.
Kutilganidek, tezkor PCR to'liq integratsiyalangan namunaga javob beradigan molekulyar diagnostika va multipleks tahlil tizimlari uchun kuchli vositadir.Rapid PCR SARS-CoV-2 ni aniqlash uchun zarur bo'lgan vaqtni sezilarli darajada qisqartiradi, bu esa COVID-19 pandemiyasini samarali nazorat qilishga yordam beradi.
PCR POCT uchun mos bo'lmagan murakkab termal tsiklni talab qiladi.Yaqinda izotermik kuchaytirish usullari mikrofluidiklarga, jumladan, LAMP, rekombinaz polimeraza kuchaytirilishi (RPA) va nuklein kislotalar ketma-ketligiga asoslangan kuchaytirishni o'z ichiga olgan, lekin ular bilan cheklanmagan holda qo'llanildi [65,66,67,68].Ushbu usullar yordamida nuklein kislotalar doimiy haroratda kuchaytirilib, molekulyar diagnostika uchun arzon, yuqori sezgir portativ POCT qurilmalarini yaratishga yordam beradi.
Yuqori o'tkazuvchanlik mikrofluidikaga asoslangan LAMP tahlillari yuqumli kasalliklarni bir nechta aniqlash imkonini beradi [42, 69, 70, 71].Santrifüj mikrosuyuqlik tizimi bilan birgalikda LAMP nuklein kislotalarni aniqlashni avtomatlashtirishni yanada osonlashtirishi mumkin [69, 72, 73, 74, 75].Spin-va-reaktiv SlipChip LAMP [76] yordamida bir nechta parallel bakteriyalarni vizual aniqlash uchun ishlab chiqilgan (4a-rasm).Tahlilda optimallashtirilgan LAMP dan foydalanilganda, floresan signali-shovqin nisbati taxminan 5 baravarni tashkil etdi va aniqlash chegarasi genomik DNKning 7,2 nusxasi/mkl ga yetdi. Bundan tashqari, beshta umumiy ovqat hazm qilish bakteriyasi patogenlarining mavjudligi, shu jumladan Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis va Vibrio parahaemolyticus, <60 daqiqada usul asosida ko'rsatildi. Bundan tashqari, beshta umumiy ovqat hazm qilish bakteriyasi patogenlarining mavjudligi, shu jumladan Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis va Vibrio parahaemolyticus, <60 daqiqada usul asosida ko'rsatildi.Bundan tashqari, ovqat hazm qilish traktining beshta keng tarqalgan bakterial patogenlari, jumladan Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis va Vibrio parahaemolyticus mavjudligi ushbu usul yordamida 60 daqiqadan kamroq vaqt ichida ko'rsatilgan.①, ② ③ ④ <60 ー x ancha, 包括 蜡状, 大 沙门 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 ↑.①, ② ③ ④ <60 ー ↑, ↑, ↑, ↑, 肠 菌, 弧菌 氏 菌, 弧菌 氏 菌, 弧菌 和 弧菌chàíí ííííí ííííí ííííí íííííBundan tashqari, ushbu usul yordamida 60 daqiqadan kamroq vaqt ichida Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvius va Vibrio parahaemolyticus kabi beshta keng tarqalgan bakterial oshqozon-ichak patogenlarining mavjudligi ingl.
Mikrofluidikada LAMP ning afzalliklari, jumladan, tez javob berish va kichiklashtirilgan aniqlashni o'z ichiga oladi.Biroq, reaksiya harorati (taxminan 70 ° C) tufayli LAMP vaqtida aerozollar muqarrar ravishda hosil bo'ladi, bu esa yuqori noto'g'ri musbat tezlikni keltirib chiqaradi.Tahlilning o'ziga xosligi, primer dizayni va haroratni nazorat qilish ham LAMP uchun optimallashtirilgan bo'lishi kerak.Bundan tashqari, bitta chipda bir nechta maqsadni aniqlashni amalga oshiradigan chip dizaynlari katta ahamiyatga ega va ishlab chiqilishi kerak.Bundan tashqari, LAMP bir chipga birlashtirilgan ko'p maqsadli aniqlash uchun javob beradi, bu katta ahamiyatga ega, ammo rivojlanish uchun hali ko'p joy mavjud.
LAMP ning yuqori noto'g'ri ijobiy tezligini RPA bilan qisman kamaytirish mumkin, chunki nisbatan past reaktsiya harorati (~ 37 ° C) bug'lanishning nisbatan kam muammolariga olib keladi [77].RPA tizimida ikkita qarama-qarshi primer rekombinaza bilan bog'lanish orqali DNK sintezini boshlaydi va amplifikasyon 10 daqiqada yakunlanishi mumkin [78,79,80,81].Shuning uchun, butun RPA jarayoni PCR yoki LAMPga qaraganda ancha tezroq.So'nggi yillarda mikrofluidik texnologiya RPA tezligi va aniqligini yanada yaxshilashi ko'rsatildi [82,83,84].Masalan, Liu va boshqalar.[85] teskari transkripsiya RPA (RT-RPA) va universal lateral oqim sinov chizigʻini aniqlash tizimini integratsiyalash orqali SARS-CoV-2 ni tez va sezgir aniqlash uchun mikrosuyuqli integratsiyalangan lateral oqim polimeraza rekombinazani kuchaytirish tahlilini ishlab chiqdi.yagona mikrosuyuqlik tizimiga aylanadi.4b-rasm).Aniqlash chegarasi 1 nusxa/ml yoki 30 nusxa/namunani tashkil qiladi va aniqlash taxminan 30 daqiqada yakunlanishi mumkin.Kong va boshqalar.taqiladigan mikrosuyuqlik qurilmasini ishlab chiqdilar.[86] RPA yordamida OIV-1 DNKsini tez va toʻgʻridan-toʻgʻri aniqlash uchun tana harorati va mobil telefonga asoslangan floresansni aniqlash tizimidan foydalangan (4c-rasm).Kiyinish mumkin bo'lgan RPA tahlili 24 daqiqa ichida maqsadli ketma-ketlikning 100 nusxasini / ml ni aniqlaydi va resurslar cheklangan sharoitlarda OIV-1 bilan kasallangan chaqaloqlarni tezkor tashxislash uchun katta imkoniyatlarni namoyish etadi.
Yordam nuqtasi sinovida (POCT) izotermik kuchaytirish.Spin va reaktsiya SlipChipni ishlab chiqish va ishlab chiqarish.Plazma payvandlashdan so'ng, yuqori va pastki chiplar yakuniy chipni hosil qilish uchun yong'oqlar to'plami bilan yig'ildi ([76] dan moslashtirilgan).b COVID-19 ni aniqlash uchun MI-IF-RPA tizimining sxemasi ([85] dan moslangan).c OIV-1 DNKsini tezkor aniqlash uchun taqiladigan RPA testining sxemasi ([86] dan moslangan).SE Salmonella enterica, VF Vibrio fluvius, VP Vibrio parahaemolyticus, BC Bacillus cereus, EC Escherichia coli, FAM karboksifloressein, inson immunitet tanqisligi virusi OIV, RPA rekombinaza polimeraza kuchaytirilishi, LED yorug'lik chiqaradigan diode-rekombinaza-rekombinaza, la-PA-Mikroaza indikatori Kuchaytirish
Mikrofluidga asoslangan RPA jadal rivojlanmoqda, ammo chip ishlab chiqarish va reaktsiya iste'moli juda yuqori va ushbu texnologiyaning mavjudligini oshirish uchun uni kamaytirish kerak.Bundan tashqari, RPA ning yuqori sezuvchanligi, ayniqsa, ifloslanish mavjud bo'lganda, o'ziga xos bo'lmagan mahsulotlarning kuchayishiga ta'sir qilishi mumkin.Ushbu cheklovlar mikrofluidik tizimlarda RPA qo'llanilishiga ta'sir qilishi va keyingi optimallashtirishga loyiq bo'lishi mumkin.POCTda RPA asosidagi mikrosuyuqlik strategiyalarining maqsadga muvofiqligini yaxshilash uchun turli maqsadlar uchun yaxshi mo'ljallangan primerlar va zondlar kerak.
Cas13 va Cas12a nuklein kislotalarni tasodifiy parchalash qobiliyatiga ega va shuning uchun aniqlash va diagnostika vositalari sifatida ishlab chiqilishi mumkin.Cas13 va Cas12a mos ravishda maqsadli DNK yoki RNK bilan bog'langanda faollashadi.Faollashtirilgandan so'ng, oqsil boshqa yaqin nuklein kislotalarni parchalay boshlaydi, shundan so'ng patogenga xos nuklein kislotalarni yo'naltiruvchi yo'naltiruvchi RNKlar o'chirilgan lyuminestsent zondlarni parchalashi va flüoresansni chiqarishi mumkin.Bu nazariyaga asoslanib, Kellner va boshqalar.[87] Cas13-ga asoslangan usulni ishlab chiqdi [Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter Unlocking (SHERLOCK)] va Broughton et al.[88] Cas12a [CRISPR Trans Reporter DNK endonuclease (DTECR) maqsadli] asosida boshqa yondashuvni ishlab chiqdi.
So'nggi yillarda CRISPR asosida nuklein kislotalarni aniqlashning turli usullari paydo bo'ldi [89, 90].An'anaviy CRISPRga asoslangan usullar ko'pincha nuklein kislotani olish, kuchaytirish va CRISPRni aniqlash kabi bir nechta protseduralar tufayli ko'p vaqt va mehnat talab qiladi.Suyuqliklarning havoga ta'siri noto'g'ri ijobiy natijalar ehtimolini oshirishi mumkin.Yuqoridagilarni hisobga olgan holda, CRISPR asosidagi tizimlar optimallashtirishga juda muhtoj.
CRISPR-Cas12a va CRISPR-Cas13a aniqlash ilovalari uchun parallel ravishda 24 ta tahlilni amalga oshirishi mumkin bo'lgan pnevmatik boshqariladigan mikrosuyuqlik platformasi ishlab chiqilgan [91].Tizim nuklein kislota kuchaytirilishini chetlab o'tuvchi va femtomolyar DNK va RNK namunalarini avtomatik ravishda aniqlaydigan floresansni aniqlash qurilmasi bilan jihozlangan.Chen va boshqalar.[92] markazdan qochma mikrofluidiklarda CRISPR-Cas12a tizimi bilan integratsiyalangan rekombinaza kuchaytirilishi (5a-rasm).Bu ish bu ikki jarayonni integratsiya qilish qiyinligini yengib chiqadi, chunki Cas12a messenjer DNKni hazm qilishi va kuchaytirish jarayonini inhibe qilishi mumkin.Bundan tashqari, Chen va boshqalar.[92] qoʻshimcha ravishda butun jarayonni avtomatik ravishda yakunlash uchun reaksiya reagentlarini markazdan qochma mikrosuyuqlik boshqaruvida oldindan saqlagan.Boshqa bir ishda Silva va boshqalar.[93] SARS-CoV-2 ni aniqlash uchun CRISPR/Cas12a kuchaytirgichi va smartfonsiz diagnostika usulini ishlab chiqdi (5b-rasm).Uyali telefonga asoslangan kuchaytirmasdan tizim sifatida tanilgan ushbu tahlil mikrosuyuqlik kanallarida katalaza hosil qilgan pufakcha signallarini smartfon vizualizatsiyasiga asoslangan CRISPR/Cas-ga bog'liq fermentni o'z ichiga oladi.Nuklein kislotaning 50 nusxa/ml dan kamligini oldindan kuchaytirmasdan sezgir aniqlash, namunani yuborishdan signalni o'qishgacha bo'lgan butun jarayon atigi 71 daqiqa davom etadi.
CRISPR asosida nuklein kislotalarni aniqlash usullari.CRISPR asosida integratsiyalangan molekulyar diagnostika uchun santrifüj POCT ([92] dan moslangan).b SARS-CoV-2 ni smartfon asosida tahlil qilish uchun CASCADE testini ishlab chiqish ([93] ga moslashtirilgan).RAA rekombinaza kuchaytirilishi, PAM qo‘shni protospacer motivi, CRISPR klasterli qisqa palindromik takrorlar muntazam intervallarda, CRISPR/CASga bog‘liq fermentlar bilan mobil telefon kuchaytirmasdan CASCADE tizimi, 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]karbodiimid gidroxlorid.
Nuklein kislotani aniqlashning oxirgi bosqichi sifatida signalni aniqlash diagnostika natijalarini bevosita aks ettiradi va samarali, sezgir va aniq POCTni ishlab chiqishda muhim omil hisoblanadi.Signallarni floresan, elektrokimyoviy, kolorimetrik va magnit strategiyalar kabi turli usullar yordamida o'qish mumkin.Ushbu bo'limda biz har bir yondashuvning mantiqiy asoslarini tavsiflaymiz va mikrofluidlarda yuqumli kasalliklarning molekulyar diagnostikasini solishtiramiz.
Flüoresansga asoslangan strategiyalar yuqumli kasalliklarning POCT diagnostikasi uchun ularning ajoyib sezuvchanligi, arzonligi, foydalanish qulayligi va tibbiy yordamni tahlil qilish kabi ajoyib afzalliklari tufayli keng qo'llaniladi [94, 95].Ushbu strategiyalar aniqlanishi mumkin bo'lgan signalni (fluoresansni kuchaytirish yoki söndürme) yaratish uchun lyuminestsent bo'yoqlar va nanomateriallar kabi etiketli floroforlardan foydalanadi.Ushbu topilma shuni ko'rsatadiki, lyuminestsentga asoslangan strategiyalarni to'g'ridan-to'g'ri lyuminestsent yorliqlash, signalni yoqish va signalni o'chirish floresan aniqlashga bo'lish mumkin [96].To'g'ridan-to'g'ri lyuminestsent yorliqni aniqlash maqsad bilan tanlab bog'langanda ma'lum miqdorda flüoresan hosil qiluvchi maxsus ligandlarni belgilash uchun maxsus floresan teglardan foydalanadi.Signalga asoslangan floresansni aniqlash uchun lyuminestsent signalning sifati qiziqish kattaligi bilan ijobiy bog'liq.Floresan intensivligi maqsad yo'qligida ahamiyatsiz va etarli miqdordagi maqsad mavjud bo'lganda aniqlanadi.Aksincha, "signalni o'chirish" floresansi bilan aniqlangan floresansning intensivligi maqsad miqdoriga teskari proportsional bo'lib, dastlab maksimal qiymatga etadi va maqsad kattalashganda asta-sekin kamayadi.Misol uchun, CRISPR-Cas13a maqsadga bog'liq trans-ajralish mexanizmidan foydalangan holda, Tian va boshqalar.[97] teskari transkripsiyani to'g'ridan-to'g'ri chetlab o'tadigan RNKlarni aniqlash uchun yangi tanib olish strategiyasini ishlab chiqdi (6a-rasm).To'ldiruvchi maqsadli RNKlar bilan bog'langandan so'ng, CRISPR-Cas13-RNK kompleksi faollashishi mumkin, bu esa o'ziga xos bo'lmagan reportyor RNKlar tomonidan transkollateral parchalanishni keltirib chiqaradi.Flüoresan yorliqli muxbir [fluorofor (F)] o'chiruvchi (Q) buzilmagan holda o'chiriladi va faollashtirilgan kompleks tomonidan ajratilganda floresanslanadi.
Elektrokimyoviy aniqlashning afzalligi yuqori aniqlash tezligi, oson ishlab chiqarish, arzon narxlardagi, tashish oson va avtomatik boshqaruvdir.Bu POCT ilovalari uchun kuchli tahliliy usul.Grafen dala effektli tranzistorlar asosida Gao va boshqalar.[98] 2 pg/mL aniqlash chegarasi bilan Borrelia burgdorferi bakteriyalaridan Lyme kasalligi antijenlarini multipleks aniqlash uchun nanobiosensor ishlab chiqdi (6b-rasm).
Kolorimetrik tahlillar POCT ilovalarida qo'llanilgan bo'lib, ular portativlik, arzon narx, tayyorlash qulayligi va vizual o'qish afzalliklaridan foydalanadi.Kolorimetrik aniqlashda maqsadli nuklein kislotalarning mavjudligi haqidagi ma'lumotni ko'rinadigan rang o'zgarishlariga aylantirish uchun peroksidaza yoki peroksidaza o'xshash nanomateriallarning oksidlanishi, nanomateriallarning agregatsiyasi va indikator bo'yoqlari qo'shilishi mumkin [99, 100, 101].Shunisi e'tiborga loyiqki, oltin nanozarrachalar kolorimetrik strategiyalarni ishlab chiqishda keng qo'llaniladi va ularning tez va sezilarli rang o'zgarishini keltirib chiqarish qobiliyati tufayli yuqumli kasalliklarning in situ diagnostikasi uchun POCT kolorimetrik platformalarini ishlab chiqishga qiziqish ortib bormoqda [102].Integratsiyalashgan santrifüj mikrosuyuqlik qurilmasi [103] bilan ifloslangan sut namunalaridagi oziq-ovqat patogenlari 10 bakterial hujayra darajasida avtomatik ravishda aniqlanishi va natijalarni 65 daqiqa ichida vizual tarzda o'qilishi mumkin (6c-rasm).
Magnit zondlash usullari magnit materiallar yordamida analitlarni aniq aniqlashi mumkin va so'nggi o'n yilliklarda POCT ilovalariga katta qiziqish bor.Magnit zondlash texnikasi qimmat optik komponentlar emas, balki arzon magnit materiallar kabi noyob afzalliklarga ega.Biroq, magnit maydondan foydalanish aniqlash samaradorligini oshiradi va namunani tayyorlash vaqtini qisqartiradi [104].Bundan tashqari, magnit zondlash natijalari biologik namunalarning ahamiyatsiz magnit fon signali tufayli yuqori o'ziga xoslik, sezgirlik va yuqori signal-shovqin nisbatini namoyish etadi [105].Sharma va boshqalar.magnit tunnel ulanishiga asoslangan biosensorni portativ mikrochip platformasiga birlashtirdi.[106] patogenlarni multipleks aniqlash uchun (6d-rasm).Biosensorlar patogenlardan ajratilgan subnanomolyar nuklein kislotalarni sezgir tarzda aniqlaydi.
Signalni aniqlashning odatiy usuli.Cas13a ning giperlokalizatsiyalangan aniqlash kontseptsiyasi ([97] dan moslangan).b Grafen nanobiosensor FET Lyme GroES scFv bilan birgalikda ([98] dan moslangan).c Santrifüj mikrosuyuq mikrosxemada oziq-ovqat patogenlarini multipleks aniqlash uchun kolorimetrik ko'rsatkichlar: maqsadli patogenlar bilan № 1 va № 3 namunalar va maqsadli patogenlarsiz № 2, № 4 va 5 namunalar ([103] dan moslashtirilgan) .d Magnit tunnel tutashuviga asoslangan biosensor, jumladan platforma, o'rnatilgan blokirovka kuchaytirgichi, boshqaruv bloki va signal ishlab chiqarish/olish uchun quvvat manbai ([106] dan moslashtirilgan).GFET Graphene FET, Escherichia coli, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, PC PC, PDMS Dimethicone, PMMA polimetil metakrilat
Yuqoridagi aniqlash usullarining ajoyib xususiyatlariga qaramay, ular hali ham kamchiliklarga ega.Ushbu usullar taqqoslanadi (1-jadval), shu jumladan ba'zi ilovalar tafsilotlari (ijobiy va kamchiliklari).
Mikrofluidika, mikroelektromexanik tizimlar, nanotexnologiya va materialshunoslikning rivojlanishi bilan yuqumli kasalliklarni aniqlash uchun mikrofluidik chiplardan foydalanish doimiy ravishda rivojlanmoqda [55,96,107,108].Miniatyura uskunalari va suyuqliklarni aniq manipulyatsiya qilish diagnostika aniqligi va iqtisodiy samaradorlikka yordam beradi.Shu sababli, keyingi rivojlanish uchun chiplarni optimallashtirish va yangilash bo'yicha sa'y-harakatlar amalga oshirildi, natijada turli xil tuzilmalar va funktsiyalarga ega bo'lgan turli mikrofluidik chiplar paydo bo'ldi.Bu erda biz mikrofluidik platformalarning bir nechta keng tarqalgan turlarini qisqacha tanishtiramiz va ularning xususiyatlarini solishtiramiz (ijobiy va salbiy tomonlari).Bundan tashqari, quyida keltirilgan misollarning aksariyati birinchi navbatda SARS-CoV-2 ga qarshi kurashga qaratilgan.
LOCClar eng keng tarqalgan miniatyuralashtirilgan murakkab analitik tizimlar bo'lib, ularning operatsiyalari juda kichiklashtirilgan, integratsiyalashgan, avtomatlashtirilgan va namunalarni quyish va tayyorlash, oqimni boshqarish va suyuqlikni aniqlashdan parallellashtirilgan [109, 110].Suyuqliklar puxta ishlab chiqilgan geometriya va bosim gradyanlari, kapillyar harakatlar, elektrodinamika, magnit maydonlar va akustik to'lqinlar kabi ko'plab jismoniy effektlarning o'zaro ta'siri orqali manipulyatsiya qilinadi [111].LOCC tez tahlil qilish tezligi, kichik namuna o'lchami, kam quvvat iste'moli va yuqori boshqaruv va ish samaradorligi bilan yuqori mahsuldorlikdagi skrining va bir nechta aniqlashda ajoyib afzalliklarni ko'rsatadi;ammo, LOCC qurilmalari juda nozik va ishlab chiqarish, qadoqlash va interfeysga ega.Biroq, multiplekslash va qayta foydalanish juda katta qiyinchiliklarga duch keladi [96].Boshqa platformalar bilan solishtirganda, LOCC maksimal dastur xilma-xilligi va eng yaxshi texnologiya muvofiqligi nuqtai nazaridan o'ziga xos afzalliklarga ega, ammo uning kamchiliklari ham aniq, ya'ni yuqori murakkablik va yomon takrorlanishdir.Ko'pincha katta hajmli va qimmat bo'lgan tashqi nasoslarga bog'liqlik ularni POCTda qo'llashni yanada cheklaydi.
COVID-19 epidemiyasi paytida LOCCga katta e'tibor qaratildi.Shu bilan birga, bir nechta texnologiyalarni birlashtirgan bir nechta yangi chiplar mavjud.Misol uchun, smartfonlar hozirda portativ analitik qurilmalar sifatida keng qo'llaniladi va LOCC integratsiyasi uchun katta imkoniyatlarga ega.Sun va boshqalar.[21] LAMP yordamida beshta patogenning, shu jumladan SARS-CoV-2 ning maxsus nuklein kislotasi ketma-ketligini multiplekslash imkonini beruvchi mikrosuyuqlik chipini ishlab chiqdi va reaksiya tugaganidan keyin 1 soat ichida smartfon yordamida tahlil qildi.Yana bir misol sifatida, Sundah va boshqalar.[112] smartfonlar yordamida SARS-CoV-2 RNK nishonlarini toʻgʻridan-toʻgʻri va sezgir aniqlash uchun molekulyar kalitni [molekulyar oʻtish holati kaliti (CATCH) orqali katalitik kuchaytirish] yaratdi. CATCH portativ LOCC bilan mos keladi va yuqori ishlashga erishadi (taxminan 8 RNK nusxasi/mkl; xona haroratida < 1 soat) [112]. CATCH portativ LOCC bilan mos keladi va yuqori ishlashga erishadi (taxminan 8 RNK nusxasi/mkl; xona haroratida < 1 soat) [112]. CATCH sovmestim s portativnym LOCC va obespechivaet prevosxodnuyu proizvoditelnost (asosiy 8 kopiy RNK/mkl; < 1 ch pri komnatnoy harorate) [112]. CATCH portativ LOCC bilan mos keladi va mukammal o'tkazish qobiliyatini ta'minlaydi (taxminan 8 RNK nusxasi/mkl; xona haroratida < 1 soat) [112]. CATCH línglíngílílílílílílílílínílíníníníníínííníínííníníníníníníníníní8 RNK língí/ml；díngíngínínă< 1 míngīngči[1][1] CATCH línglíngílílílílílílílílínílíníníníníínííníínííníníníníníníníníní8 RNK língí/ml；díngíngínínă< 1 míngīngči[1][1] CATCH sovmestim s portativnymi LOCC va obladaet prevosxodnoy proizvoditelnostyu (asosiy 8 kopiy RNK/mkl; < 1 soat pri komnatnoy harorat) [112]. CATCH portativ LOCClar bilan mos keladi va mukammal ishlashga ega (taxminan 8 RNK nusxasi/ml; xona haroratida < 1 soat) [112].Bundan tashqari, molekulyar diagnostika uchun LOCC qurilmalari vakuum, cho'zish va elektr maydonlari kabi ba'zi harakatlantiruvchi kuchlardan ham foydalanadi.Kang va boshqalar.[113] vakuumli plazma suyuq PCR chipi yordamida dalada COVID-19 ning tez va miqdoriy diagnostikasi uchun real vaqt rejimida, ultra tez nanoplazma-chipda PCRni namoyish etdi.Li va boshqalar.[114] keyinchalik choʻziladigan mikrosuyuqlik chipini ishlab chiqdi, bu esa COVID-19 tashxisini qoʻyish imkonini berdi.Platforma namunaning sifat jihatidan ijobiy yoki salbiy ekanligini aniqlash uchun RT-LAMP kuchaytirish tizimidan foydalanadi.Keyinchalik, Ramachandran va boshqalar.[115] mikrofluidikada qo'llaniladigan selektiv ion fokuslash usuli bo'lgan izotakoforez (ITP) yordamida tegishli elektr maydon gradientlariga erishdi.ITP bilan xom nazofarengeal tampon namunalaridan maqsadli RNK avtomatik ravishda tozalanishi mumkin.Keyin Ramachandran va boshqalar.[115] Ushbu ITP tozalashni ITP bilan yaxshilangan LAMP va CRISPR tahlillari bilan birlashtirib, taxminan 35 daqiqada inson nazofarengeal tampon va klinik namunalarida SARS-CoV-2 aniqlandi.Bundan tashqari, doimiy ravishda yangi g'oyalar paydo bo'ladi.Jadhav va boshqalar.[116] vertikal yoʻnaltirilgan oltin/kumush bilan qoplangan uglerod nanotubalarini yoki bir martalik ishlatiladigan elektrospun mikro/nanotubalarni oʻz ichiga olgan mikrosuyuqlik qurilmasi bilan birgalikda sirtni kengaytirilgan Raman spektroskopiyasiga asoslangan diagnostika sxemasini taklif qildi.Membran bilan ishlaydigan o'rnatilgan filtr mikrokanallari bir martalik.Qurilma tupurik, nazofarenks va ko'z yoshlari kabi turli tana suyuqliklari/ekssudatsiyalaridan viruslarni o'zlashtiradi.Shunday qilib, virus titri juda ko'p va virusni Raman imzosi bilan aniq aniqlash mumkin.
LOAD - markazdan qochma mikrosuyuqlik platformasi bo'lib, unda barcha jarayonlar mikrostrukturali substratni aylantiruvchi chastota protokoli bilan boshqariladi [110].LOAD qurilmasi markazdan qochma kuchni muhim harakatlantiruvchi kuch sifatida ishlatish bilan tavsiflanadi.Suyuqliklar kapillyar, Eyler va Koriolis kuchlariga ham ta'sir qiladi.Santrifüj moslamasi yordamida tahlillar suyuqlikning radial ichkaridan tashqariga qarab doimiy ishlashida amalga oshiriladi, bu esa qo'shimcha tashqi quvurlar, nasoslar, aktuatorlar va faol klapanlarga bo'lgan ehtiyojni yo'q qiladi.Muxtasar qilib aytganda, bitta nazorat usuli operatsiyani soddalashtiradi.Yuklash markazidan bir xil masofada joylashgan bir xil mikrosuyuqlik kanalidagi suyuqlikka ta'sir qiluvchi kuchlar teng bo'lib, bu kanal tuzilishini takrorlash imkonini beradi.Shunday qilib, LOAD uskunalari an'anaviy LOCC uskunasiga qaraganda dizayn va ishlab chiqarishda sodda va tejamkor bo'lib, reaksiyalar asosan mustaqil va parallel;ammo, markazdan qochma uskunaning yuqori mexanik kuchi tufayli mavjud chip materiallari cheklangan va kichik hajmlar qiyin.mashinaga.Shu bilan birga, ko'pchilik LOAD qurilmalari faqat bir martalik foydalanish uchun mo'ljallangan, bu katta hajmdagi aniqlash uchun qimmatga tushadi [96, 117, 118, 119].
So'nggi o'n yilliklarda eng istiqbolli mikrofluidik qurilmalardan biri hisoblangan LOAD tadqiqotchilar va ishlab chiqaruvchilar tomonidan katta e'tiborga sazovor bo'ldi.Shunday qilib, LOAD keng qabul qilingan va yuqumli patogenlarning molekulyar diagnostikasi uchun ishlatilgan [120, 121, 122, 123, 124], ayniqsa COVID-19 epidemiyasi davrida.Masalan, 2020 yil oxirida Ji va boshqalar.[60] SARS-CoV-2 va gripp A va B infektsiyalarini tez va avtomatlashtirilgan parallel aniqlash uchun to'g'ridan-to'g'ri RT-qPCR tahlilini ko'rsatdi.Keyin Xiong va boshqalar.[74] 40 daqiqa ichida SARS-CoV-2 ni oʻz ichiga olgan yettita odamning nafas olish yoʻllari koronavirusini tez, aniq va bir vaqtda aniqlash uchun LAMP bilan oʻrnatilgan diskoid mikrofluid platformasini taqdim etdi.2021 yil boshida de Oliveyra va boshqalar.[73] COVID-19 ning RT-LAMP molekulyar diagnostikasi uchun barmoq uchi rotatori bilan qoʻlda boshqariladigan santrifüjli polistirolli toner mikrosuyuqlik chipini namoyish etdi.Keyinchalik, Dignan va boshqalar.[39] SARS-CoV-2 RNK ni toʻgʻridan-toʻgʻri bukkal tampon qismlaridan tozalash uchun avtomatlashtirilgan koʻchma santrifüj mikroqurilmasini taqdim etdi.Medved va boshqalar.[53] aniqlash chegarasi 10 nusxa/mkl va minimal aylanish chegarasi 15 daqiqa bo'lgan kichik hajmli aylanadigan mikrosuyuq lyuminestsent chipli SARS-CoV-2 aerozol namunalarini olish tizimini taklif qildi.Suares va boshqalar.[75] yaqinda LAMP yordamida issiqlik bilan inaktivlangan nazofarengeal tampon namunalarida SARS-CoV-2 RNK ni to'g'ridan-to'g'ri aniqlash uchun o'rnatilgan modulli markazdan qochma mikrosuyuqlik platformasi ishlab chiqilgani haqida xabar berdi.Ushbu misollar COVID-19 ning molekulyar diagnostikasida LOAD ning katta foydalari va va'dalarini namoyish etadi.
1945 yilda Myuller va Klegg [125] birinchi bo'lib filtr qog'ozi va parafin yordamida qog'ozda mikrosuyuqlik kanallarini taqdim etdilar.2007 yilda Whitesides guruhi [126] oqsil va glyukoza sinovlari uchun birinchi funktsional qog'oz platformasini yaratdi.Qog'oz mikrofluidlar uchun ideal substratga aylandi.Qog'oz gidrofillik va gözeneklilik, mukammal bio-moslik, engil vazn, moslashuvchanlik, katlanuvchanlik, arzon narx, foydalanish qulayligi va qulaylik kabi o'ziga xos xususiyatlarga ega.Klassik µPADlar qog‘oz substratlarga qurilgan gidrofil/hidrofobik tuzilmalardan iborat.Uch o'lchovli tuzilishiga ko'ra, mPADlarni ikki o'lchovli (2D) va uch o'lchovli (3D) mPADlarga bo'lish mumkin.2D µPADlar mikrosuyuqlik kanallarini hosil qilish uchun hidrofobik chegaralarni hosil qilish yo‘li bilan ishlab chiqariladi, 3D mkPAD esa odatda 2D mikrofluidik qog‘oz qatlamlaridan, ba’zan qog‘ozni katlama, sirpanish texnikasi, ochiq kanallar va 3D bosib chiqarish orqali tayyorlanadi [96].mPADdagi suvli yoki biologik suyuqliklar, birinchi navbatda, tashqi quvvat manbaisiz kapillyar kuch bilan boshqariladi, bu reagentlarni oldindan saqlashni, namunalarni qayta ishlashni va multipleksni aniqlashni osonlashtiradi.Biroq, oqimni to'g'ri boshqarish va multipleksni aniqlash etarli darajada aniqlanmagan tezlik, sezgirlik va qayta foydalanishga to'sqinlik qiladi [96, 127, 128, 129, 130].
Noodatiy mikrosuyuqlik platformasi sifatida mPAD HCV, OIV va SARS-CoV-2 [131, 132] kabi yuqumli kasalliklarning molekulyar diagnostikasi uchun keng targ'ib qilingan va ishlab chiqilgan.HCV ni selektiv va sezgir aniqlash uchun Tengam va boshqalar.[133] pirolidinil peptidga asoslangan yuqori o'ziga xos nuklein kislota probi yordamida floresan qog'ozga asoslangan yangi biosensorni ishlab chiqdi.Nuklein kislotalar qisman oksidlangan tsellyuloza qog'ozida aminokislotalar va aldegid guruhlari o'rtasida qaytaruvchi alkillanish yo'li bilan kovalent immobilizatsiya qilinadi va aniqlash floresansga asoslangan.Ushbu signallarni mobil telefon kamerasi bilan birgalikda portativ lyuminestsent kameraga ega maxsus ishlab chiqarilgan gadjet orqali o'qish mumkin.Keyinchalik, Lu va boshqalar.[134] DNK redoks indikatori sifatida metilen ko'k yordamida DNK gibridizatsiyasi orqali OIV nishonini aniqlash uchun nikel/oltin nanozarralari/uglerod nanotubalari/polivinil spirti organometalik ramka kompozitlariga asoslangan qog'ozga asoslangan moslashuvchan elektrodni ishlab chiqdi.Yaqinda Chowdury va boshqalar.[135] COVID-19 analitini aniqlash uchun LAMP va portativ tasvirlash texnologiyasi bilan birgalikda bemorning xom so'lakidan foydalangan holda tibbiy yordam punktida µPAD sinovi uchun faraziy platforma dizaynini taqdim etdi.
Yanal oqim sinovlari suyuqliklarni kapillyar kuchlar orqali boshqaradi va suyuqlikning harakatlanishini gözenekli yoki mikroyapılı substratlarning namlanishi va xususiyatlari bilan boshqaradi.Yanal oqim qurilmalari namuna, konjugat, inkubator va aniqlash va changni yutish yostiqchalaridan iborat.LFAdagi nuklein kislota molekulalari bog'lanish joyida oldindan saqlanadigan va komplekslar sifatida bog'langan o'ziga xos bog'lovchilarni taniydi.Suyuqlik inkubatsiya va aniqlash plitalari orqali o'tayotganda, komplekslar sinov va nazorat chiziqlarida joylashgan tutib olish molekulalari tomonidan ushlanib, to'g'ridan-to'g'ri yalang'och ko'z bilan o'qilishi mumkin bo'lgan natijalarni ko'rsatadi.Odatda, LFA 2-15 daqiqada bajarilishi mumkin, bu an'anaviy kashfiyotdan tezroq.Maxsus mexanizm tufayli LFA bir nechta operatsiyalarni talab qiladi va qo'shimcha uskunalarni talab qilmaydi, bu esa uni juda qulay qiladi.Ishlab chiqarish va miniatyura qilish oson va qog'ozga asoslangan substratlarning narxi pastroq.Biroq, u faqat sifatli tahlil uchun ishlatiladi va miqdoriy aniqlash juda qiyin, multiplekslash qobiliyati va o'tkazish qobiliyati juda cheklangan va bir vaqtning o'zida faqat bitta etarli nuklein kislota aniqlanishi mumkin [96,110,127].
LFA ning ko'pgina ilovalari immunoassaylarga qaratilgan bo'lsa-da, mikrofluidik chiplarda molekulyar diagnostika uchun LFA dan foydalanish ham samarali va mashhurdir [136].Gepatit B virusi, OIV va SARS-CoV-2 LFA Gong va boshq.[137] yuqoriga ko'tariladigan nanozarracha LFA platformasini taklif qildi va HBV nuklein kislotasi kabi bir nechta maqsadlarni sezgir va miqdoriy aniqlash orqali ushbu miniatyuralashtirilgan va ko'chma platformaning ko'p qirraliligini ko'rsatdi.Bundan tashqari, Fu va boshqalar.[138] past konsentratsiyalarda OIV-1 DNKning miqdoriy tahlili uchun sirt yaxshilangan Raman spektroskopiyasiga asoslangan yangi LFAni namoyish etdi.SARS-CoV-2 ni tez va sezgir aniqlash uchun Liu va boshqalar.[85] RT-RPA va universal lateral oqimni aniqlash tizimini yagona mikrofluidik tizimga birlashtirib, mikrosuyuqlik bilan integratsiyalangan RPA lateral oqim tahlilini ishlab chiqdi.
Turli mikrofluidik platformalarni qo'llash platformalarning imkoniyatlari va afzalliklaridan to'liq foydalangan holda aniq tadqiqotlarga qarab farqlanadi.Arzon narxlardagi klapanlar, nasoslar va kanallar bilan LOCC dastur xilma-xilligi va o'zaro ishlash uchun eng keng qamrovli platforma bo'lib, rivojlanish uchun eng katta imkoniyatlarga ega.Shuning uchun biz umid qilamiz va eng yangi tadqiqotlar LOCCda birinchi urinish sifatida o'tkazilishini va shartlarni optimallashtirishni tavsiya qilamiz.Bundan tashqari, tizimda yanada samarali va aniq usullarni kashf qilish va qo'llash kutilmoqda.LOAD mavjud LOCC qurilmalaridagi suyuqliklarni aniq nazorat qilishda ustunlik qiladi va tashqi drayvlar kerak bo'lmasdan markazdan qochma kuch bilan yagona drayvlarda noyob afzalliklarni namoyish etadi, parallel javoblar alohida va sinxronlashtirilishi mumkin.Shunday qilib, kelajakda LOAD kamroq qo'lda operatsiyalar va ko'proq etuk va avtomatlashtirilgan texnologiyalarga ega bo'lgan asosiy mikrofluidik platformaga aylanadi.µPAD platformasi arzon narxlardagi, bir martalik diagnostika uchun LOCC va qog‘ozga asoslangan materiallarning afzalliklarini birlashtiradi.Shuning uchun kelajakdagi rivojlanish qulay va yaxshi o'rnatilgan texnologiyalarga e'tibor qaratishi kerak.Bundan tashqari, LFA yalang'och ko'zni aniqlash uchun juda mos keladi, namuna iste'molini kamaytirish va aniqlashni tezlashtirishni va'da qiladi.Platformani batafsil taqqoslash 2-jadvalda keltirilgan.
Raqamli tahlillar namunani ko'plab mikroreaktorlarga ajratadi, ularning har biri alohida miqdordagi maqsadli molekulalarni o'z ichiga oladi [139, 140].Raqamli tahlillar minglab parallel biokimyoviy tajribalarni bir vaqtning o'zida va doimiy fazada emas, balki mikron shkalasi bo'linmalarida individual ravishda bajarish orqali mutlaq miqdorni amalga oshirish uchun muhim afzalliklarni taqdim etadi.An'anaviy mikrofluidika bilan solishtirganda, bo'linma reaktsiyalari namuna hajmini kamaytirishi, reaktsiya samaradorligini oshirishi va kanallar, nasoslar, klapanlar va ixcham dizaynlarga ehtiyoj sezmasdan boshqa analitik usullar bilan osongina birlashtirilishi mumkin [141, 142, 143, 144, 145, 146, 147].Eritmalarni, shu jumladan hujayralar, nuklein kislotalar va boshqa zarrachalar yoki molekulalar kabi reagentlar va namunalarni bir xil va aniq ajratishga erishish uchun raqamli tahlillarda quyidagi ikkita usul qo'llaniladi: (1) suyuqlik interfeysi beqarorligidan foydalanadigan tomchi emulsiyalar;(2) massiv bo'linishi qurilmaning geometrik cheklovlari bilan amalga oshiriladi.Birinchi usulda mikrokanallardagi reagentlar va namunalarni o'z ichiga olgan tomchilar passiv usullar bilan yaratilishi mumkin, masalan, birgalikda oqim, o'zaro oqim, oqim fokuslash, bosqichli emulsifikatsiya, mikrokanal emulsifikatsiyasi va membranalarni yopishqoq kesish kuchlari va kanal o'zgarishi bilan emulsifikatsiya qilish.mahalliylashtirish [143, 145, 146, 148, 149] yoki faol usullardan [150, 151] foydalanib, elektr, magnit, issiqlik va mexanik nazorat orqali qo'shimcha energiya kiritadi.Oxirgi yondashuvda, mikrosuyuqlik kameralarida suyuqlik hajmining eng yaxshi bir xilligi mikropitlar va sirt massivlari kabi bir xil o'lchamdagi fazoviy tuzilmalarni saqlash orqali taqsimlanadi [152,153,154].Ta'kidlash joizki, tomchilar oqimning asosiy qismlari bo'lib, ular raqamli mikrofluidikaga (DMF) asoslangan elektrod massivlarida ham yaratilishi va boshqarilishi mumkin.Dielektriklarning elektr tokini o'rganish eng yaxshi o'rganilgan DMF nazariyalaridan biridir, chunki dielektriklarni elektr namlash turli tomonlardan o'tadigan suyuqlik va assimetrik elektr signallarining shaklini nazorat qiluvchi individual tomchilarni aniq boshqarish imkonini beradi [141, 144].DMFda tomchilar bilan asosiy operatsiyalar saralash, bo'lish va birlashtirishni o'z ichiga oladi [151, 155, 156], ular tahlilning turli sohalarida, ayniqsa molekulyar aniqlashda qo'llanilishi mumkin [157, 158, 159].
Raqamli nuklein kislotani aniqlash an'anaviy PCR va miqdoriy real vaqtda PCR (qPCR) dan keyingi uchinchi avlod molekulyar diagnostika texnologiyasi bo'lib, yuqori samarali ketma-ketlik va suyuqlik biopsiyasi bilan parallel ravishda.So'nggi yigirma yil ichida raqamli nuklein kislotalar yuqumli patogenlarning molekulyar diagnostikasi sohasida jadal rivojlandi [160, 161, 162].Raqamli nuklein kislotani aniqlashning mutlaq miqdorini aniqlash har bir maqsadli ketma-ketlikning har bir alohida bo'limga kirish ehtimoli bir xil bo'lishini ta'minlash uchun namunalar va reagentlarni alohida bo'limlarga qadoqlashdan boshlanadi.Nazariy jihatdan, har bir bo'limga bir nechta maqsadli ketma-ketliklar tayinlanishi mumkin yoki mustaqil mikroreaktsiya tizimi bo'lmasligi mumkin.Yuqorida tavsiflangan turli xil sezish mexanizmlari orqali ma'lum bir chegaradan yuqori signallarni ishlab chiqaradigan mikrobial maqsadli ketma-ketliklarga ega bo'linmalar yalang'och ko'z bilan yoki mashinada ko'rsatilishi mumkin va ular ijobiy deb belgilanishi mumkin, chegara ostidagi signallarni ishlab chiqaradigan boshqa bo'limlar esa ijobiy deb etiketlanadi. .salbiy bo'lganlar, bu har bir bo'lim uchun signalni mantiqiy qiladi.Shunday qilib, yaratilgan bo'limlar sonini va reaktsiyadan so'ng ijobiy natijalar tezligini hisoblab, sinov namunalarining asl nusxalarini muntazam miqdoriy tahlillar uchun zarur bo'lgan standart egri chiziqqa ehtiyoj sezmasdan Puasson taqsimot formulasi yordamida moslashtirish mumkin. qPCR sifatida.[163] An'anaviy molekulyar diagnostika usullari bilan taqqoslaganda, raqamli nuklein kislotani aniqlash yuqori darajadagi avtomatlashtirishga, yuqori tahlil tezligi va sezgirligiga, kamroq reagentlarga, kamroq ifloslanishga va sodda dizayn va ishlab chiqarishga ega.Shu sabablarga ko'ra, molekulyar diagnostika uchun raqamli tahlillardan, ayniqsa tomchiga asoslangan usullardan foydalanish, kuchaytirish va signalni o'qish usullarini birlashtirgan holda, SARS-CoV-2 ning jiddiy epidemiyasi paytida yaxshi o'rganilgan.Masalan, Yin va boshqalar.[164] mikrosuyuqlik chipida SARS-CoV-2 da ORF1ab, N va RNase P genlarini aniqlash uchun tomchi raqamli va tezkor PCR usullarini birlashtirdi.Shunisi e'tiborga loyiqki, tizim 115 soniya ichida ijobiy signalni aniqlay oldi, bu an'anaviy PCRga qaraganda tezroq, bu uning yordam nuqtasini aniqlashda samaradorligini ko'rsatadi (7a-rasm).Dong va boshqalar.[165], Sow va boshqalar.[157], Chen va boshqalar.[166] va Alteri va boshqalar.[167], shuningdek, SARS-CoV-2 ni mikrosuyuqlik tizimida ta'sirchan natijalar bilan aniqlash uchun tomchili raqamli PCR (ddPCR) qo'lladi.Aniqlash tezligini yanada yaxshilash uchun Shen va boshqalar.[168] ddPCR-ga asoslangan chip tasvirini 15 soniya ichida tasvirni tikish texnikasidan foydalanmasdan amalga oshirdi, bu esa ddPCR texnologiyasi jarayonini laboratoriyadan qo'llashgacha tezlashtirdi.Reaksiya sharoitlarini va tezkor javobni soddalashtirish uchun nafaqat PCR kabi termal kuchaytirish usullari, balki izotermik kuchaytirish usullari ham qo'llaniladi.Lu va boshqalar.[71] tomchilarni tahlil qilish uchun SlipChip-ni ishlab chiqdi, u bir bosqichda yuqori zichlikdagi turli o'lchamdagi tomchilarni hosil qila oladi va raqamli LAMP yordamida SARS-CoV-2 nuklein kislotalari miqdorini aniqlaydi (7b-rasm).Tez rivojlanayotgan texnologiya sifatida CRISPR nuklein kislotasini qo'shimcha dog'larsiz qulay kolorimetrik tasvirlash orqali raqamli nuklein kislotani aniqlashda ham muhim rol o'ynashi mumkin.Ackerman va boshqalar.nuklein kislotalarni multipleks baholash uchun kombinatsion matritsa reaksiyasini ishlab chiqdi.[158] mikroquyruq tahlilida CRISPR-Cas13 asosidagi nuklein kislotani aniqlash reagentlarini o'z ichiga olgan tomchilarda SARS-CoV-2ni o'z ichiga olgan 169 ta inson bilan bog'liq viruslarni aniqladi (7c-rasm).Bundan tashqari, izotermik kuchaytirish va CRISPR texnologiyasi ikkalasining afzalliklarini birlashtirish uchun bir xil tizimda ishlatilishi mumkin.Park va boshqalar.[169] CRISPR/Cas12a raqamli tahlili qisqaroq va yuqoriroq signalni fonga aniqlash bilan bir bosqichli RT-RPA asosida ekstraksiya qilingan va issiqlik bilan oʻldirilgan SARS-CoV-2 ni aniqlash uchun tijorat mikrosuyuqlik chipida ishlab chiqilgan. vaqt nisbati., kengroq dinamik diapazon va yaxshi sezuvchanlik (7d-rasm).Ushbu misollarning ba'zi tavsiflari 3-jadvalda keltirilgan.
Nuklein kislotani aniqlash uchun odatiy raqamli platforma.a Tez raqamli PCR ish jarayoni to'rtta asosiy bosqichdan iborat: namunani tayyorlash, reaktsiya aralashmasini taqsimlash, kuchaytirish jarayoni va maqsadli miqdorni aniqlash ([164] dan moslangan).b Yuqori zichlikdagi tomchilar hosil bo'lishi uchun SlipChip tomchilarini tahlil qilish sxemasi ([71] dan moslashtirilgan).c CARMEN-Cas ish oqimi diagrammasi13 ([158] dan moslashtirilgan).d Bir qozonda CRISPR/Cas yordamida ilg'or raqamli viruslarni aniqlashning umumiy ko'rinishi ([169] dan moslashtirilgan).Yog 'ichida suv, polidimetilsiloksan PDMS, PCR polimeraza zanjiri reaktsiyasi, DAQ ma'lumotlarini to'plash, PID proportsional integral hosilasi, multipleks nuklein kislotani baholash uchun CARMEN kombinatoryal matritsa reaktsiyasi, SARS-CoV-2, og'ir o'tkir respirator sindrom, koronavirus2, RT teskari transkriptaza rekombinaz polimeraza-RPA kuchaytirilishi, fonda S/B signali